恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达

目的 :裂殖子表面抗原 2基因 (Merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )是恶性疟原虫的一种保护性抗原 ,为研究其重组BCG疫苗的保护作用 ,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC 1 HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG MSA2在卡介苗 (BacillusCalmetteGuerin ,BCG)中的表达情况。方法 :采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG MSA2导入BCG中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9Broth (M7H9)培养基 ,并添加 10 %M7H9EnrichmentADC和 0 0 5 %Tween80 ,4周后于 4 5℃进行诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS PAGE)及免疫印迹 (Western blot)分析。结果 :SDS PAGE及Western blot分析结果均显示在约 31kDa的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符。结论 :恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在BCG中表达 。

我国不同疟区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究

目的 了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫裂殖子表面蛋白 - 1基因多态性及其分布。方法 用套式PCR扩增间日疟原虫现场分离株MSP - 1第五多态区 (ICB5 -ICB6 )基因片段 ,部分样本进行序列测定、分析和比对。结果 82份间日疟原虫现场分离株扩增出 4 70bp片段 5 0份 ,4 0 0bp片段 39份 ,其中 7份为两种片段的混合型。海南分离株混合型为 2 0 %(6 / 30 ) ,平均克隆数为 1 2 0 (36 / 30 ) ,安徽分离株混合型仅为 2 3% ,平均克隆数 1 0 2。对 33份样本进行序列测定 ,Sal- 1型17份 ,Belem型 2份 ,12份重组型 (Ⅲ型 )和朝鲜型 2份为我国新发现基因型。结论 我国间日疟原虫PvMSP - 1存在 4种不同的等位基因型 ,以Sal- 1型和重组型 (Ⅲ型 )占优势 ,南部疟区基因型比北部复杂。

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA1第二区基因的克隆和序列分析

本文应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株ＭＳＡ１第二区基因，测定并分析了基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株扩增片段长度为４２３ｂｐ，基因序列完全相同，我国虫株ＭＳＡ１与ＷＥＬＬＣＯＭＥ株最为相似，存在ＭＡＤ和Ｋ１两种等位基因型的基因内重组现象。

用间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因分析福建输入性疟疾病例

[目的 ]探讨福建输入性疟疾的分子流行病学特征 ,追踪传染源。[方法 ]病人血样用套式PCR RFLP检测 ,扩增PvMSP 1基因ICB5 ICB6片段 ,测定DNA序列并进行BLAST相似性搜索和进化树分析。 [结果 ] 16例镜检确诊的间日疟病人血样经套式PCR RFLP检测 ,7份属Sal 1型 ,1份为Belem型 ,8份为重组Ⅲ型。对其中 7份样本PCR产物进行DNA直接测序 ,发现没有两个DNA序列完全相同 ,PvMSP 1基因ICB5 ICB6片段存在高度多态性 ,DNA序列搜索结合流行病学调查可初步确定感染来源。 [结论 ]PvMSP 1基因用于疟疾基因分型和判断感染来源有一定价值 ,可作为疟疾分子流行病学调查的方法之一。

辽宁丹东间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因型分析

用套式PCR方法扩增辽宁丹东地区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)基因ICB5-ICB6片段,经PvuⅡ酶切和琼脂糖凝胶电泳,对产物进行序列分析。结果显示,11份镜检确诊的间日疟患者血液标本经套式PCR扩增均出现大小约为470 bp(Sal-1型)或400 bp(Belem型)的特异性片段。经PvuⅡ内切酶消化后,其中5份血样(470 bp),出现120和350 bp酶切片段,为Sal-1型;其余6份血样(400 bp)中,1份出现400 bp片段,为Belem型,1份出现120和280 bp两种酶切片段,为重组Ⅲ型,4份出现120和240 bp两种酶切片段,为朝鲜型。辽宁省丹东地区的间日疟原虫PvMSP-1基因存在3种不同的等位基因型,以Sal-1型和朝鲜型为主,但无不同等位基因型的混合感染。

非洲输入性恶性疟病例裂殖子表面蛋白1等位基因型检测

目的了解输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)等位基因型特征。方法采集非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,采用巢式PCR方法,用恶性疟原虫MSP1基因特异引物扩增疟原虫虫株MSP1基因第2区与第3区部分片段,并对MSP1等位基因型进行分析。结果 135例输入性恶性疟患者中检出MSP1等位基因117例,检出率为86.7%。117例扩增阳性的患者中,MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33和MAD20+K1+RO33型的检出率分别为6.0%(7/117)、36.8%(43/117)、20.5%(24/117)、6.8%(8/117)、3.4%(4/117)、17.1%(20/117)和9.4%(11/117),其中混合型感染占36.8%(43/135),MSP1等位基因多重感染平均数(MOI)为1.46。MAD20型、K1型和RO33型恶性疟患者中重症患者比例差异无统计学意义(P>0.05);74例单一型和43例混合型感染者中重症患者比例分别为25.7%(19/74)和32.6%(14/43),2种感染者回国前在国外停留的平均天数分别为(241±176)d和(285±216)d,两者间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论非洲输入性恶性疟患者感染的疟原虫MSP1基因的3种基因型和4种混合型均存在,以K1型和RO33型为优势基因型。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

目的将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端msp1-42基因(3D7株)导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。方法利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫(3D7株)msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选(叶片切碎、在含500mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株)3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。结果构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10d后黄化或白化,再经约30d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900bp与500bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。结论获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。

套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(pfMSP1)和表面蛋白 2 (pfMSP2 )等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR法分别扩增pfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段和pfMSP2基因的中间可变区 (第 3区 ) ,对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型。结果 5 5份血样中有 5 2份恶性疟疾患者扩增出pfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (84 6 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型 ,两种不同等位基因混合感染率为 15 4 %。同时 ,5 5份血样中有 5 3份恶性疟疾患者扩增出pfMSP2基因片段 ,以 3D7型为主导型 (83% ) ,FC2 7型为次要型 ,混合感染率为 17%。结论 海南省恶性疟原虫的MSP1存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株 ;其MSP2存在 3D7型和FC2 7型两种等位基因型 ,以 3D7等位基因家族为主。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的 为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７），本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因，并纯化及鉴定了表达蛋白。方法 将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １，形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌，纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果 成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７，转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ），纯化后纯度达７２％ ，ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论 成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白，为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７

我国华南间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因分型和序列分析

目的 了解我国间日疟原虫MSP1(PvMSP1)的等位基因类型和序列的多态性。方法 用特异的引物通过套式PCR方法体外扩增包含PvMSP1的ICB5与ICB6之间的基因片段 ,并对部分扩增产物进行序列测定和分析。结果 2 7份间日疟原虫患者血样中 ,有 16份 (5 9 9% )扩增得到Belem型基因产物 ,2 5 (92 6 % )份扩增出Sal- 1型基因产物 ;两种不同等位基因型虫株的混合感染率为 5 1 9%。序列分析结果发现一个以前未见报告的基因内重组类型。结论 我国间日疟原虫虫株存在两种PvMSP1等位基因型 ,Sal- 1型可能是主导型 ;

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 DNA与改良痘苗病毒组合疫苗诱导小鼠抗体应答

目的探索DNA与改良痘苗病毒(MVA)组合免疫对增强恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)抗体应答的作用。方法以人工合成MSP1全基因为基础分别构建DNA免疫质粒VR1020/190和重组MVA,单用VR1020/190或与表达质粒GM-CSF共同对小鼠进行初始免疫后,用重组病毒追加强化,采用DNA/MVA组合方案免疫BALB/c小鼠,ELISA测定血清IgG及其亚类水平,经腹腔接种转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19进行攻击。结果DNA免疫能有效诱导小鼠产生抗MSP1-190抗体,其终点稀释度为1∶2500,GM-CSF质粒共免疫组抗体的终点稀释度为1∶11150,抗体亚类的测定表明GM-CSF质粒显著促进了IgG1类抗体应答,MVA追加可使单独免疫组和共免疫组抗体分别增加53和10倍;两实验组产生了水平相近的抗19000抗体(1∶32000),其含量占血清中MSP1总IgG的1/4-1/3。经转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19攻击后小鼠的存活时间并没有明显延长(P>0.05)。结论采用合成MSP1全基因进行DNA/MVA组合免疫可诱导小鼠产生显著的抗体应答,抗体的详细特性和保护作用正在进一步研究中。

堆型艾美耳球虫子孢子表面抗原基因cSZ1的克隆及序列分析

根据已报道的堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计特异性引物,以孢子化12h的E.acervulina广东株卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆了其子孢子表面抗原基因cSZ1(cSZ1(Gd))的cDNA。所克隆cSZ1(Gd)的cDNA全长940bp,其中第3～512位是其阅读框架,共编码170个氨基酸,两端为非编码区。与已报道的cSZ1基因的cDNA序列相比,cSZ1(Gd)有4个位置的核苷酸发生了变异,即原序列中第294、443、569、586位的G、G、G、A在cSZ1(Gd)分别为A、A、A、G,二者核苷酸序列的同源性为99.57%(936/940),其中阅读框架的核苷酸同源性为99.61%(508/510)。比较根据核苷酸序列推导的氨基酸序列,第294位的变异导致了所编码氨基酸由缬氨酸(V)变为异亮氨酸(I),而第443位的变异则为无义突变,氨基酸序列的同源性为99.41%(169/170)。

疟原虫裂殖子主要表面蛋白1(MSP1)的研究进展

本文简述了疟原虫裂殖子主要表面蛋白1(MSP1)的分子结构、功能以及在人群中诱导的免疫应答。对恶性疟原虫MSP1疫苗的动物和人体试验结果进行了分析,对MSP1作为疟疾诊断抗原分子和疟疾疫苗候选抗原的应用前景进行了探讨。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端片段基因核酸疫苗的构建

核酸疫苗能引起明显的细胞免疫反应,在体内为真核天然表达,不需体外表达、纯化等繁琐工作;已有相当数量的试验表明其可引起明显的免疫保护.目前疟原虫仅有关鼠疟约氏疟红前期核酸疫苗的报道[Sedegah M et al.ProcNatl Acad Sci USA,1994;

间日疟原虫裂殖子表面蛋白3α基因多态性研究

目的分析我国部分地区间日疟原虫裂殖子表面蛋白3α(PvMSP-3α)基因多态性。方法套式PCR分别对PvMSP-3α和间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因进行扩增,并应用限制性片段多态性(RFLP)对PvMSP-3α的PCR扩增产物酶切进行分析。结果31个PvMSP-3α基因型中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型比例分别占77.42%、6.45%和16.13%。其中云南勐腊24份样本中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分别占79.17%、4.17%和16.17%。PvMSP-3α的Ⅱ型和Ⅲ型均为PvMSP-1的Belem型,而PvMSP-1的Sal-1型均为PvMSP-3α中的Ⅰ型。结论云南分离株的PvMSP-3α存在广泛多态性,PvMSP-3α和PvM-SP-1之间的联系有待于进一步探讨。

间日疟原虫不同MSP-1等位基因型形态学观察

目的 比较两种不同等位基因型间日疟原虫生物学形态特征。方法 现场采集间日疟病人血样并进行基因分型 ,镜下观察形态并测量大小。结果与结论 72份现场分离株基因分型为Sal- 1型 4 0份 ,Belem型 2 5份 ,混合感染 7份 ,均查到典型的间日疟原虫 ,6例多重感染病例均发现在海南分离株 ,多重感染与基因型混合感染无关联。测量正常红细胞、寄生红细胞、环状体以及核大小差别有显著意义 ,Belem型比Sal- 1型大 。

恶性疟原虫云南勐捧分离株裂殖子顶端膜抗原Ⅰ序列分析

根据文献报道的恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原IDNA序列的保守区，设计并合成两对20聚寡核苷酸作引物，对恶性疟原虫勐捧分离株DNA进行PCR扩增。扩增产物经BamHI和EcoRI双酶解后，克隆入具有相应末端的M13mp8和M13mp8载体，转化JPA101，生长于含X－gal的培基上，抽提无色噬菌斑DNA，以DNA序列测定仪进行DNA序列测定，并自动翻释成氨基酸序列。用双脱氧终止法测定部分DNA序列，并与DNA序列测定仪测定的序列进行比较。结果表明，扩增的序列长度为1773个碱基，编码591个氨基酸。与参照序列比较，有17个点突变，引起15个密码子的取代，其中，除1个密码子为同义取代外，其余密码子均为非同义取代，造成14个氨基酸的取代。点突变在序列中呈散在分布，但在氨基酸序列中第160－210位相对较集中。

间日疟原虫MSP-1和CSP基因遗传多样性的分析

目的比较间日疟原虫两种主要分子标志(MSP1和CSP)的遗传多样性。方法分别用MSP1和CSP基因分型方法鉴定间日疟原虫现场分离株,并进行基因多态性比较和分析。结果共检测32份海南省现场确诊的间日疟病人血样,MSP1等位基因型混合感染率为18.75%,平均克隆数1.16;CSP基因型混合感染率为35.29%,平均克隆数为1.47。如果同时考虑两种基因型,混合感染率则为50.00%。空间对应分析发现,热带族与Sal1型关系密切,PvⅡ型与重组Ⅲ型分布靠近,其他基因型则较分散。结论同时用MSP1和CSP两种分子标志检测间日疟原虫,其基因型混合感染率高于用单一标志检测,两种标志检测结果存在一定对应关系。

赤道几内亚比奥科岛恶性疟原虫MSP-1和MSP-2基因多态性研究

目的研究赤道几内亚比奥科岛(Bioko Island)恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1(PfMSP-1)基因和裂殖子表面蛋白2(PfMSP-2)基因分型。方法从比奥科岛采集疟疾患者血样181份,用显微镜法和荧光定量PCR鉴定虫种。采用巢式PCR分别扩增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特异性的片段,进行等位基因分型。结果 PfMSP-1基因分型:181份恶性疟患者血样中有178份扩增出PfMSP-1基因片段(98.34%),其中K1、MAD20和RO33基因型片段分别为171份(94.48%)、175份(96.69%)和126份(69.61%)。混合感染率为97.24%;PfMSP-2基因分型:181份血样中有173份PfMSP-2基因片段(95.58%),其中48份(26.52%)单独扩增到3D7型基因片段,4份(2.21%)单独扩增到FC27型基因片段,混合感染率为66.85%。结论赤道几内亚比奥科岛PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型分布范围极广。混合感染是比奥科岛疟疾的主要类型。

BCG载体携带恶性疟MSP-1和MSP-2基因免疫小鼠实验研究

目的研究恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)和表面蛋白-2(MSP-2)与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法将重组pBCG/MSP-1和pBCG/MSP-1-2多价疫苗经皮下注射BALB/c小鼠,经多价疫苗免疫8周后,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化,并体外培养脾细胞,用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化,体外测定了抗体介导的抑制实验。结果与对照组相比,疫苗组CD4+和CD8+T淋巴细胞有显著性增高,体外培养的脾细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应,抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论恶性疟原虫FCC-1/HNpBCG/MSP-1和pBCG/MSP-2价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。