裂殖酵母TSC1和TSC2蛋白的昆虫细胞表达、纯化和蛋白性质探讨

结节性硬化症是一种在多器官发生良性肿瘤而表现出不同临床病症的常染色体显性疾病,由肿瘤抑制基因TSC1(tuberous sclerosis 1)和TSC2发生突变所致。这两个基因编码的蛋白形成TSC1/2复合物,在m TOR信号通路中整合上游生长信号,负调控细胞的合成代谢。该复合物的结构学研究有助于揭示其调控机理。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达来自裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)与人同源的TSC1和TSC2及其截短和突变蛋白。纯化结果表明,裂殖酵母TSC1以二聚体的形式存在;TSC1结合TSC2,TSC1/2复合物会聚合成分子量大于1 000 k Da的多聚体;亲和纯化带Flag标签的TSC2,同时TSC2结合TSC1,可得到纯度高的TSC1/2复合物;TSC1需要其卷曲螺旋(coiled-coil)来稳定TSC2;TSC1 1-718 aa或1-799 aa和TSC2全长共表达有利于提高TSC2的表达量;TSC2的N-端和GAP结构域可以分开,TSC1和TSC2的N-端结合。总之,该研究阐释了裂殖酵母TSC1和TSC2的一些结构性质,提出的TSC1和TSC2表达纯化方法为其结晶研究奠定了重要基础。