三萜皂苷生物合成途径研究进展

三萜皂苷是一类重要的植物次生代谢产物,在体外具有抗癌、抗病毒、降低胆固醇等药理学作用。由于三萜皂苷生物合成途径中的关键酶在细胞中的表达水平较低,决定了其在植物中的含量低,因而对其生物合成途径的探讨具有重要的现实意义和应用价值。

川西獐牙菜SmSLS2基因的克隆、生物信息学及表达分析

裂环马钱子苷合成酶(SLS)是环烯醚萜类化合物合成途径的限速酶。该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得SmSLS2基因序列,对该基因进行克隆、生物信息分析、原核表达载体构建及蛋白体外诱导。结果表明SmSLS2 cDNA全长1 566 bp(GenBank编号MH535904),编码521个氨基酸,推测其蛋白相对分子质量为59. 79kDa,等电点为8. 92。结构域分析表明SmSLS2含一个跨膜结构域,SmSLS2的gDNA全长为2 576 bp,含5个外显子和4个内含子。SmSLS2蛋白与其他植物中SLS蛋白具有高度的相似性。进一步将SmSLS2构建到原核表达载体pET-28a-sumo上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在37℃、0. 5 mmol·L^(-1)IPTG条件下进行原核表达,诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。该研究成功从川西獐牙菜中克隆了SmSLS2,为进一步阐明该基因在环烯醚萜合成途径中的作用和通过基因工程手段改良环烯醚萜类化合物产量提供了理论基础。

黄管秦艽中总裂环烯醚萜苷对白细胞介素-1β诱导下大鼠软骨细胞的影响

目的通过考查甘肃习用药材黄管秦艽栽培种和野生种中总裂环烯醚萜苷对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的大鼠软骨细胞的影响,探讨栽培种和野生种黄管秦艽中总裂环烯醚萜苷治疗骨关节炎(osteoarthritis,OA)的可行性。方法取大鼠关节软骨细胞第4代,将第4代软骨细胞分为4组:空白组(A组)软骨细胞用完全培养基培养;白细胞介素-1β诱导组(B组)软骨细胞以10ng·mL-1重组大鼠白细胞介素-1β培养24 h;白细胞介素-1β和栽培种黄管秦艽总裂环烯醚萜苷组(C组:分为C1组50μg·mL-1;C2组200μg·mL-1;C3组400μg·mL-1)软骨细胞以10 ng·mL-1重组大鼠白细胞介素-1β和栽培种黄管秦艽总裂环烯醚萜苷(以下称栽培组)培养24 h;白细胞介素-1β和野生种黄管秦艽总裂环烯醚萜苷组(D组:分为D1组50μg·mL-1;D2组100μg·mL-1;D3组200μg·mL-1)软骨细胞以10 ng·mL-1重组大鼠白细胞介素-1β和野生种黄管秦艽总裂环烯醚萜苷(以下称野生组)培养24 h。培养后取各组细胞进行免疫细胞化学染色,收集细胞培养液,检测其上清液中表达前列腺素E2的情况。结果四甲基偶氮唑蓝法结果显示,栽培组(50、200、400μg·mL-1)对软骨细胞作用24 h时无毒性作用,野生组(50、100、200μg·mL-1)对软骨细胞作用24 h时无毒性作用。免疫细胞化学染色显示,栽培组和野生组与诱导组相比Ⅱ型胶原阳性表达明显增强,但弱于空白组,并且随着质量浓度的增大Ⅱ型胶原阳性表达逐渐增强,差异有统计学意义(P<0.05)。酶联免疫法结果显示,栽培组和野生组与诱导组相比前列腺素E2含量明显降低,但高于空白组,并且随着质量浓度的增大前列腺素E2含量越低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论栽培种和野生种黄管秦艽中的总裂环烯醚萜苷均对炎症软骨细胞具有一定的保护作用。

喜树CaSLS基因的克隆、表达分析和功能鉴定

对喜树碱合成途径中的关键酶——裂环马钱子苷合酶(CaSLS)的编码基因序列进行扩增,通过基因表达量分析和酵母异源表达进行功能鉴定。该基因大小为1575 bp,共编码524个氨基酸,编码蛋白理论分子质量为59.88 ku。构建表达质粒pESC-Leu2d-CaCPR1-CaSLS转入酵母菌株,通过HPLC-MS检测酵母提取物发现,CaSLS成功将底物马钱子苷和马钱子酸催化形成裂环马钱子苷和裂环马钱子酸,说明CaSLS基因表达的酶蛋白具有生物活性和催化功能。q-RT-PCR结果表明,CaSLS基因在植物体内的表达量呈明显的组织特异性和时空特异性,在嫩叶中表达量最高,在老茎中表达量最低,推测其主要在嫩叶中发挥作用。

金银花中1个新的环烯醚萜苷类化合物

目的研究金银花Lonicerae Flos的化学成分。方法采用HP-20大孔吸附树脂柱色谱、ODS柱色谱、HW-40柱色谱和高效液相色谱等多种色谱分离手段进行分离纯化,利用波谱学方法鉴定化合物的结构。结果从金银花60%乙醇提取物中分离得到了6个化合物,分别鉴定为demethylsecologanol-7-O-arabinoside(1)、8-表番木鳖酸(2)、断马钱子苷半缩醛内酯(3)、sweroside(4)、secologanoside(5)、secoxyloganin(6)。结论化合物1为一个新的环烯醚萜苷类化合物,命名为裂环马钱子苷A。

HPLC法测定不同产地忍冬藤中4种环烯醚萜苷

目的建立HPLC法测定忍冬藤中4种环烯醚萜苷的方法。方法使用Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)梯度洗脱,0～10min,10%～14%A;10～35min,14%A;体积流量1.0mL/min,检测波长236nm。柱温30℃。结果裂环马钱子苷酸、马钱苷、当药苷、secologanoside-7-methylester分别在0.8064～32.256μg、2.136～85.44μg、0.7936～31.744μg、0.7824～31.296μg呈良好线性关系;回收率分别为101.27%、98.50%、101.34%、101.36%,RSD分别为2.30%、1.54%、2.10%、1.87%;结论所建立的方法简便、准确、重复性好,可用于同时测定忍冬藤中4种环烯醚萜苷的量。

二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因小鼠痴呆模型GSK3β,PKA,PP2A的影响

目的:观察二苯乙烯苷(TSG)对淀粉样前体蛋白/早老蛋白-1/Tau(APP/PS1/Tau)三转基因小鼠阿尔茨海默病(AD)模型脑组织中糖原合成酶激酶3β(GSK3β),环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(PKA),磷酸丝氨酰/磷酸苏氨酰蛋白磷酸酶2A(PP2A)的表达影响。方法:8月龄APP/PS1/Tau三转基因小鼠45只,随机分为模型组、石杉碱甲组(石杉碱甲,0.15 mg·kg^(-1)),TSG低、中、高剂量组(TSG,0.033,0.1,0.3 g·kg^(-1)),每组9只。另取同龄C5B7L/6J小鼠9只为正常组。各组灌胃60 d相应药物后,采用苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠海马神经元的一般结构;免疫组化(IHC)检测各组小鼠脑组织PKA蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测GSK3β,PKA,PP2A mRNA表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GSK3β,PP2A蛋白表达情况。结果:与正常组比较,模型组小鼠神经元细胞的凋亡水平显著升高,GSK3β,PKA蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.01),PP2A蛋白及mRNA表达水平显著下调(P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠神经元细胞凋亡水平显著下调,GSK3β,PKA蛋白及mRNA表达水平明显下调(P<0.05,P<0.01),PP2A蛋白及mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:TSG治疗AD的机制可能与降低GSK3β和PKA mRNA表达水平与蛋白表达水平,提高PP2A的mRNA表达水平与蛋白表达水平等机制有关。

大肠癌组织中TS和COX-2的表达及其与患者无病生存期的关系

目的:探讨大肠癌患者癌组织中环氧化酶-2(COX-2)、胸苷酸合成酶(TS)的表达及其与患者无病生存期的关系。方法:筛选我院收治的大肠癌根治术患者,选择无病生存期大于48个月者30例和无病生存期小于48个月者29例。采用免疫组化法检测大肠癌组织中COX-2和TS的表达,并分析其与患者无病生存期的关系。结果:49例结直肠癌患者中,TS的阳性表达率为91.84%,COX-2的阳性表达率为77.55%。不同无病生存期的大肠癌患者TS的表达水平比较无统计学差异(P=0.646)。COX-2在无病生存期>48个月的患者癌组织中表达水平明显低于无病生存期<48个月的患者,差异有统计学意义(P=0.033)。结论:COX-2与大肠癌患者的无病生存期显著相关,可能成为预测大肠癌预后的参考指标。

UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中热毒宁注射液13个潜在质量标志物及其药动学研究

目的基于中药质量标志物(qualitymarker,Q-Marker)概念,采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法建立同时测定血浆中热毒宁注射液13个潜在Q-Marker含量的方法,并用于大鼠体内血药浓度测定及药动学研究,以证明其体外-体内传递过程的可测性。方法采用Waters AQUITY UPLC C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相为0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱,体积流量0.3 mL/min;柱温为35℃,自动进样器温度为4℃;进样量为2μL。以氯霉素为内标,采用电喷雾离子源(ESI),负离子源,多反应离子检测(multiple reaction monitoring,MRM)模式,同时定量血浆中13个Q-Marker(栀子苷、京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、山栀苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、裂环氧化马钱子苷、裂环马钱子酸、獐牙菜苷)含量。采用Phoenix WinNonlin8.1软件非房室模型计算药动学参数。结果13个化合物在检测范围内线性关系良好。大鼠血浆中内源性物质不干扰测定,该方法回收率、基质效应、精密度、准确度和稳定性均符合生物样品的测定要求。尾iv热毒宁注射液后在大鼠血浆中可检测到上述13个化合物,裂环马钱子酸在血浆中暴露量最大,栀子苷和绿原酸次之。各化合物在体内半衰期较短,消除速率快;表观分布容积提示所有化合物呈广泛组织分布。结论该方法可以同时定量血浆中热毒宁注射液的13个成分,证明了上述成分体外-体内传递过程的可测性;药动学研究表明上述成分还具有血浆-组织/靶器官传递性,可作为热毒宁注射液安全性和有效性评价的潜在Q-Marker。