裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体的构建及大肠杆菌菌影的制备

目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助基因葡萄球菌核酸酶A(SN)基因串联,并插入pGEX-6P-1载体,构建双基因串联高效表达载体pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,制备大肠杆菌菌影。结果裂解基因E单基因及串联基因已成功插入融合表达载体pGEX-6P-1,所构建的大肠杆菌菌影表达载体pGEX-E、pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,诱导后经透射电镜及活菌计数显示大肠杆菌已发生不同程度裂解,制成了大肠杆菌菌影。电镜下菌影形态完整,内容物已释放到胞外。结论已成功构建了噬菌体裂解基因E单基因及裂解基因和核酸酶基因串联基因表达载体,并制成了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗及佐剂形式奠定了基础。

噬菌体裂解基因E原核表达载体构建及大肠杆菌菌影的制备

根据Genbank已知序列,设计1对引物,采用PCR方法扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,经克隆、鉴定及序列测定分析,将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建了能够在大肠杆菌中表达裂解基因E的载体pGEX-E,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后成功获得了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗制备方法和新的疫苗佐剂奠定了基础。

基于λ噬菌体裂解基因表达的PHB分离新工艺

将S基因琥珀突变的λ噬菌体裂解基因 (S-RRz)引入产聚 β 羟基丁酸酯 (PHB)的重组大肠杆菌VG1(pTU14 )中以实现细胞的可控裂解破壁 .采用EDTA/Tris (pH值 8 0 )缓冲液处理结果表明 ,S-RRz在VG1(pTU14 )中能够成功表达 ,且EDTA对细胞裂解的决定性作用是由于它模拟了S基因产物的功能 .当细胞内PHB含量为 85 %～ 90 %时 ,大量积累的PHB颗粒可以改变细胞膜的通透性 ,实现重组细胞的内控自裂解 .对PHB与细胞进行直接分离的后处理工艺研究表明 ,在S-RRz成功表达的基础上 ,采用升温处理模拟S基因产物的功能诱导细胞自裂解 ,PHB产品纯度可以达到 95 %以上 .

三种噬菌体裂解基因对大肠杆菌致死效果的比较

为比较3种噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E对大肠杆菌的致死效果,本研究将噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E克隆于严谨调控的高效表达载体pN15E6中,构建重组质粒pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE和pN15E6-E,分别转化入JM109和DH31soplacI二种大肠杆菌中,观察重组大肠杆菌在含IPTG诱导剂平板培养基上的生长情况,判定M-lysis、mE、E基因过表达对大肠杆菌宿主的影响。结果显示,在大肠杆菌JM109菌株中,mE基因过表达仅表现出抑制细菌生长的效果;M-lysis基因过表达部分致死细菌,存活菌生长受到抑制;E基因过表达能够致死绝大部分细菌,但有少量耐受菌生长。在大肠杆菌DH31soplacI菌株中,M-lysis与mE基因过表达也能致死绝大部分细菌,有少量耐受菌生长;而E基因过表达则完全致死涂布于平板上经106稀释的菌株,未见任何菌落生长。将重组菌株稀释后经平板菌落计数,测得M-lysis、mE、E基因过表达后对DH31soplacI菌株致死率分别为99.03%、99.68%和99.9998%,表明E基因过表达后对宿主菌的致死作用最强;同时定期测定培养的3种重组菌OD600nm值,并绘制生长曲线,结果显示过表达E基因能够迅速致死和裂解细菌。本研究为进一步开发噬菌体裂解肽奠定基础,也为探究细菌致死机理提供了一种新模型。

保加利亚乳杆菌噬菌体CC34裂解基因的克隆表达及功能鉴定

通过PCR的方法对保加利亚乳杆菌噬菌体CC34中e基因进行克隆,构建了表达载体pET-28b(+)-e,转入大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下进行表达,并通过SDS-PAGE对表达结果进行分析和溶菌试验。结果表明,成功构建了裂解基因e的表达体系,并初步鉴定e基因为裂解基因。

若干裂解基因盒子的表征及应用

裂解作为合成生物学中的常见功能模块单元,在基因线路设计方面具有广泛的运用。裂解主要通过诱导表达噬菌体的裂解基因盒子实现,不过,尚未有关于裂解基因的详细表征。本研究首先利用阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统在大肠杆菌(Escherichia coli)Top10表达了5种裂解基因盒子(S105,A52G,C51S S76C,LKD,LUZ),通过OD_(600)值的测量,表征了在不同生长阶段、诱导剂浓度、质粒拷贝数等条件下,含有不同裂解基因盒子的大肠杆菌菌株Top10的裂解行为。结果表明,虽然5种裂解基因盒子在大肠杆菌内都可以有效引起宿主的裂解,但是裂解行为在不同条件下有较大差异。进一步地,由于诱导系统在不同宿主之间背景表达水平的差异,导致在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1中难以构建可诱导的裂解系统。经过筛选,通过基因组插入的方式,利用鼠李糖诱导系统对裂解基因盒子在铜绿假单胞菌中引起的裂解行为进行表征。结果显示,LUZ和LKD具有较强的使铜绿假单胞菌裂解的能力,而S_(105)、A52G、C51S S76C对铜绿假单胞菌的裂解能力较差。最后,利用LUZ和光遗传学工具BphS,通过调整核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)的强度,构建了可在指定表面黏附并裂解的工程菌Q16,该菌株具有应用于表面修饰的巨大潜力。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶(Adsl)基因多态性及其与肌苷酸含量相关研究

腺苷琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一,催化嘌呤核苷酸合成过程中的两个重要反应:(1)由SAC IAR生成AICAR的反应;(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应。本研究对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因的cDNA进行了克隆,并对序列进行了分析,共发现有6处碱基突变:249G→A(TH),717 C→G(TH),985 A→G(TH)仅在泰和乌骨鸡中出现;992 T→C(RW),1400 C→T(RW)仅在隐性白羽肉鸡中出现;而在泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡中均检测到突变1179 A→C(TH,RW)。其中985 A→G(TH),1400 C→T(RW)处突变导致两处氨基酸突变:Thr→A la(305),A la→Val(443),其它4处碱基突变均为同义突变。

5个鸡种腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因外显子9 SNP及其与鸡肉肌苷酸含量的相关分析

根据腺苷琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子9的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现9 839位碱基发生了突变,由C突变为A,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,发现突变后引起ADSL基因第273位氨基酸由Pro突变为Thr,为错义突变。经独立性检验,发现基因型频率和基因频率分布与品种有关,但进一步方差分析并没有显示出该位点的多态性与胸肌的IMP含量之间存在关联。

单增李斯特菌膜裂解相关基因缺失突变株的构建及生物学特性鉴定

拟探明单核细胞增多性李斯特菌(单增李斯特菌)分离株M7可能的低致病力机制。利用SOE-PCR及同源重组法构建M7膜裂解相关基因hly及plcB单缺失(M7-Δhly和M7-ΔplcB)及双缺失突变株(M7-Δhly/plcB),比较它们与亲本株的生物学特性差异。结果如下:PCR及反转录PCR表明突变株构建成功。突变株M7-Δhly和M7-Δhly/plcB因hly缺失致其溶血活性丧失。plcB缺失突变株M7-ΔplcB和M7-Δhly/plcB无可见溶脂活性。单缺失突变株M7-ΔplcB、M7-Δhly与M7具有相似的细胞黏附及增殖能力(P>0.05)。MOI为1 000时,双缺失突变株M7-Δhly/plcB对Caco-2细胞毒性最低(11.10%),M7-Δhly次之(23.53%)(P<0.05)。空斑试验表明菌株M7和M7-ΔplcB仅能在无庆大霉素培养基中形成空斑。hly及plcB缺失致单增李斯特菌对免疫抑制小鼠毒力降低。单增李斯特菌M7低致病力可能与hly及plcB的高水平表达有关,致细菌对宿主细胞毒性增强而从细胞内逸出,使其不能躲避宿主免疫系统而被清除。

家鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因多态性与肌苷酸含量的关联及其与红原鸡的亲缘关系

根据腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子2的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、白耳鸡、藏鸡以及红色原鸡两个亚种进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现3484位碱基处发生C→T突变。对3种基因型的肌肉肌苷酸含量的最小二乘分析结果显示TT型(突变型)个体的肌肉肌苷酸含量极显著地高于CT型、显著地高于CC型个体,CT型个体也稍高于CC型,但差异不显著,初步推测该位点可能与肌肉肌苷酸含量有关。根据该多态位点的基因频率,基于Nei氏的遗传距离运用NJ聚类法构建系统发生树,进行家鸡与原鸡的亲缘关系分析,结果发现,丝羽乌骨鸡与白耳鸡的亲缘关系最近,藏鸡和中国红原鸡亚种的亲缘关系也较近,中国地方家鸡品种与中国红原鸡亚种的亲缘关系较近,而与泰国红色原鸡的亲缘关系较远,隐性白羽鸡与原鸡亲缘关系最远,初步得出中国家鸡有自己独自的血缘来源的结论。

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43'中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。

剑麻苯丙氨酸裂解酶基因的鉴定及表达分析

剑麻是热带地区重要的纤维作物,但其分子生物学研究基础薄弱,纤维发育机制尚未明确。苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是纤维重要组分木质素生物合成的起始酶,近年来转录组测序技术快速发展,使开展剑麻PAL基因相关研究更为便利。本文根据已报道转录组数据成功鉴定出2个含完整编码序列的剑麻PAL基因,其在剑麻叶片发育过程中的表达模式与前人报道的PAL在纤维发育过程中的活性变化规律一致,表明其与木质素生物合成密切相关。遗传进化分析结果显示,剑麻和番麻PAL基因进化关系更近,选择压力分析结果显示,剑麻和番麻PAL基因序列选择压力一致且高于太匮龙舌兰PAL基因,这一现象可能由剑麻和番麻纤维性状的趋同进化引起。此外,剑麻PAL基因在铜铅胁迫后差异表达不显著,其可能在重金属胁迫后受到转录后调控。值得一提的是,在烟草疫霉侵染后,剑麻PAL基因表达水平上调倍数较高,其可能同时参与苯丙烷类代谢途径中抗病相关次生代谢产物的合成和细胞壁介导的免疫机制。因此开展剑麻PAL基因功能解析可加深对剑麻纤维发育机制和抗病机制的理解,对培育高产、优质、多抗剑麻新品种具有重要意义。

万寿菊类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1克隆与表达分析

【目的】克隆万寿菊(Tagetes erecta L.‘Scarletade’)类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1(TeCCD1),分析其序列特征和表达特性,为阐明其在类胡萝卜素降解途径中生物学功能及进一步探讨万寿菊花色形成机理提供理论基础。【方法】依据万寿菊花蕾转录组数据,利用同源序列比对结果设计引物,结合RT-PCR技术克隆获得万寿菊CCD1 cDNA全长,分析其序列特征;利用Real-time PCR分析舌状花未开花蕾、半开花蕾、开放的头状花序和完全开放的头状花序4个不同发育时期的基因表达特性。【结果】克隆获得万寿菊CCD1(Gen Bank登录号:KX557488)的cDNA全长序列为1 746 bp,编码区长度1 626 bp,编码541个氨基酸。蛋白质分析表明TeCCD1为不稳定蛋白,不含信号肽,属RPE65超家族(登录号:PF03055),包含CCD家族保守结构域,主要定位于细胞质。万寿菊CCD1核酸序列与除虫菊CCD1同源性最高,为89%;氨基酸序列分析表明万寿菊CCD1与除虫菊CCD1同源性高达93%,与其他19个不同种属的CCD1同源性在75%—83%,说明TeCCD1是高度保守的基因;系统进化树分析显示TeCCD1的进化基本符合植物分类学的进化规律,并具有明显的种属特征,万寿菊与菊科同源基因亲缘关系最近。Real-time PCR分析表明TeCCD1在舌状花发育过程中均有表达,随舌状花的开放逐渐升高,S4期达到最大值。【结论】克隆获得万寿菊舌状花的CCD1,是典型的CCD家族成员,为高度保守的基因,主要定位于细胞质,万寿菊舌状花颜色变浅可能与CCD1表达量增加导致类胡萝卜素降解有关。

女性胆固醇侧链裂解酶基因中(tttta)n多态性

目的研究中国女性胆固醇侧链裂解酶基因(CYP11α)启动子中(tttta)n的遗传多态性分布以及与体重指数和腰臀比之间的关系,比较分析其发生频率与高加索人发生频率的差异。方法测量中国女性的体重、身高、腰围和臀围,并采用Chelex-100法从血标本中提取总DNA。特异引物聚合酶链反应(PCR扩增),经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测。结果被调查女性CYP11α启动子中(tttta)n多态性有6条等位基因片段,即(tttta)4,(ttt-ta)6,(tttta)7,(tttta)8,(tttta)9,(tttta)10,频率分别是0.207,0.667,0.003,0.105,0.001,0.006。与高加索女性CYP11α启动子中(tttta)n等位基因频率比较,差异有统计学意义,P<0.05;被调查女性各基因型之间的体质指数和腰臀比无统计学差异。结论CYP11α启动子中的(tttta)n多态性对被调查女性的体质指数和腰臀比没有影响。

脂氢过氧化物裂解酶基因对生菜遗传转化的研究

枸橘(Ponarus trifoliata)是一类含植物气味成分较高的植物。从枸橘中分离气味物质合成的关键基因—脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)基因,并构建35S启动子驱动下的表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入生菜中,经PCR和Southern杂交检测。结果显示:有数十个阳性植株,且经RT-PCR和Northern杂交鉴定HPL基因可在生菜中正常转录。

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。

裂解素-金属蛋白酶33基因单核苷酸多态性与支气管哮喘易感性分析

目的探讨裂解素-金属蛋白酶33基因(ADAM33)单核苷酸多态性与支气管哮喘发病的关系。方法选择20例临床诊断为哮喘的患儿(中度哮喘14例,重度6例),另取20例健康体检儿童作为对照,应用直接测序的方法,确定ADAM33基因12136位点处是否存在单核苷酸多态性。结果在20例哮喘患儿,ADAM33基因12136处未检测到突变。结论本地区人群该位点的突变率较低,可能与不同种族不同区域具有不同的突变位点有关。[临床儿科杂志,2007,25(12):1008-1011]

鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因适用性进化分析

采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以肝脏总RNA为模板,对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)编码区序列进行克隆和测序;并结合Gen-Bank中已提交的家鸡、鱼类、哺乳动物和人类等ADSL基因序列,采用基于最大似然法的密码子置换模型分析ADSL基因编码区序列在进化过程中承受的选择压力。结果RT-PCR方法准确获得了泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡ADSL基因编码区序列,全长为1 380bp。"分支特异模型"检验结果表明,ADSL基因在不同物种进化过程中较为保守,未受到正选择作用。鸡ADSL基因序列的"位点特异模型"检验未发现正选择位点。研究结果有助于了解鸡ADSL基因的结构及进化历程。

噬菌体vB_EcoM-Bp7裂解酶基因的密码子使用偏性分析

通过生物信息学软件对噬菌体vB_EcoM-Bp7裂解酶基因的密码子用法及偏性分析。利用Mobyle中的CodonW 1.4.4及cusp程序计算密码子偏性的各种指标,并对7个噬菌体裂解酶基因序列中的总GC含量、密码子第1、2位GC含量平均值和第3位的GC含量进行分析,利用MegAlign软件对7株噬菌体裂解酶进行氨基酸序列分析,构建系统发育树。结果表明,除噬菌体phi68外,Bp7裂解酶基因与其他5株噬菌体的裂解酶基因密码子使用模式基本一致。偏爱使用以A或U为结尾的密码子;除了AUG(Met)和UGG(Trp)外,还确定了Bp7裂解酶使用的12种高频密码子;偏性比较发现,Bp7裂解酶基因密码子偏性与IME08最相近,与JS98次之;进化分析及聚类分析均表明Bp7裂解酶基因与IME08亲缘关系最近。分析结果将为进一步研究噬菌体Bp7的进化奠定基础。

ATP柠檬酸裂解酶基因多态性与妊娠期糖尿病的相关性

目的探讨ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)基因多态性与妊娠期糖尿病(GDM)的相关性。方法选取2017年3月至2019年5月于我院行定期产检的519例孕妇,根据国际妊娠合并糖尿病研究组织制定的GDM诊断标准,将其中诊断为GDM的264例孕妇作为GDM组,将诊断为正常的255例孕妇作为对照组。采用Sequenom飞行质谱进行SNP位点基因型检测,分析SNP位点rs2304497和rs9912300在不同遗传模型下与GDM发病风险的相关性。结果通过遗传模型分析rs9912300位点GG,GT和TT基因型发现,加性模型下rs9912300突变基因型与GDM发病风险降低显著相关(OR=0.59,P=0.04)。位点rs2304497不同基因型与GDM发病风险无显著关联。结论ACLY基因SNP位点rs9912300与GDM发病风险存在关联,有望成为GDM发病风险的预测指标。