嗜热毁丝菌裂解性多糖单加氧酶TtLPMO9I的酶学性质及其功能研究

【目的】为挖掘新型裂解性多糖单加氧酶(LPMO)酶资源,探究LPMO在辅助降解纤维素过程中起到的重要作用。【方法】从Thermothelomyces thermophilus基因组中克隆表达了一个新型LPMO酶TtLPMO9I,系统地分析了其序列及结构的进化特征;采用DNS法表征了TtLPMO9I的酶学性质;在反应体系中添加不同浓度的抗坏血酸探究外部电子供体对TtLPMO9I活性的影响;以玉米秸秆和微晶纤维素为底物,通过检测还原糖的生成量计算获得TtLPMO9I与纤维素酶的协同作用效果。【结果】TtLPMO9I在60℃,pH 5.0时表现出最佳酶活力。在60℃孵育12 h后,仍能剩余54%的活性。经pH 6.0-8.0处理12 h后,酶活无损失。添加外部电子供体抗坏血酸使TtLPMO9I的活性提高至184%。在玉米秸秆和微晶纤维素降解过程中,TtLPMO9I与纤维素酶表现出良好的协同作用效果。将50-200μg的TtLPMO9I添加至降解体系中,还原糖产量分别提高了34%-142%和6%-46%。【结论】TtLPMO9I不仅具有良好的温度稳定性和pH稳定性,在木质纤维素的降解过程中也具有突出的作用效果,为工业生产应用提供了潜在的优质酶资源。

几丁质裂解性多糖单加氧酶的表达及应用研究

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶(Cs LPMO)为研究对象,在克隆Cs LPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析,利用3种表达质粒p ET-22b、pET-28a和pCold,构建Cs LPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EBL-Co。重组Cs LPMO蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,筛选最佳表达质粒,对其表达条件进行优化。结果表明,Cs LPMO是一种裂解性多糖单加氧酶,隶属于AA10家族。3株重组菌中,纯化重组酶蛋白相对含量分别为5.9%、4.1%、5.4%,比酶活力分别为155.42 U/mg、80.26 U/mg、148.29 U/mg,因此,确定最佳质粒为pET-22b,菌株EBL-22表达条件为:OD600 nm值至0.4时,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4 mmol/L后,在25℃下诱导表达16 h。在优化条件下,其可溶性蛋白含量为928.32 mg/L,比酶活力为3.34 U/m L。Cs LPMO的加入可使还原糖的产量提高1.67倍。

大肠杆菌分泌表达裂解性多糖单加氧酶发酵条件的优化

裂解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一种铜离子依赖型的氧化酶,可以降解生物质中的顽固多糖。因此,LPMOs在木质纤维素转化为生物燃料或其他有价值的寡糖方面得到了广泛的研究。该研究对来源嗜热毁丝霉的MtC1 LPMO在大肠杆菌中进行了异源表达,首先研究了不同信号肽对重组蛋白表达的影响,结果表明PelB信号肽可以成功将MtC1 LPMO分泌至细胞外,提高了MtC1 LPMO的总可溶性蛋白含量。为进一步提高MtC1 LPMO胞外表达量,对诱导时期、诱导剂浓度、诱导温度、发酵时间和乙醇浓度进行了优化。实验结果表明,在培养基OD 600值达到0.9时,添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG和终体积分数为2%的乙醇,然后于30℃发酵16 h后重组MtC1 LPMO的表达量最高,可溶性蛋白总含量为12.65 mg/L,为优化前的2.05倍。其中细胞外蛋白含量也达到了最高,为8.51 mg/L,细胞外比率为67.30%,以2,6-二甲氧基苯酚为底物在标准条件下测定的比活力为10.3 U/g。

裂解性多糖单加氧酶HcLPMO与纤维素酶协同降解纤维素

【目的】为研究HcLPMO的活性测定方法及其与纤维素酶的协同降解特性。【方法】利用大肠杆菌表达系统进行HcLPMO异源表达,研究以AmplexTM Ultra Red为荧光底物的LPMOs活性检测条件;研究HcLPMO与纤维素酶最优配比协同降解微晶纤维素及其他多种生物质底物的能力。【结果】表达条件确定最适装液量为20%,最适诱导温度为20℃。活性测定研究结果表明HcLPMO需先与铜离子结合才具有活性,电子供体抗坏血酸钠(ASC)最适浓度为10^(-4) mol/L,并发现Amplex^(TM) Ultra Red浓度以及辣根过氧化物酶浓度对酶活的检测影响较小。HcLPMO与纤维素酶协同降解微晶纤维素研究确定HcLPMO与纤维素酶最优配比为2:3,葡萄糖产量相较纤维素酶单独作用提高了99.48%。此外,针对多种生物质底物,发现该酶与纤维素酶的复配体系对汽爆玉米秸秆和微晶纤维素的协同降解效果较好,相较于单独用纤维素水解酶,葡萄糖产量分别提高了63.81%和59.43%,而对碱处理玉米芯和木薯渣降解效果次之,葡萄糖产量仅分别提高35.41%和11.06%。【结论】HcLPMO与纤维素酶复配能够有效提高酶法降解纤维素效率;而底物前处理如蒸汽爆破或碱处理对于HcLPMO与纤维素酶协同降解木质纤维素影响较大。

米曲霉裂解性多糖单加氧酶的异源表达与性质分析

【目的】裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一类以氧化方式断裂多聚糖糖苷键的新型木质纤维素降解酶,本文旨在挖掘新型LPMOs并研究其性质。【方法】从米曲霉中克隆LPMO基因,利用毕赤酵母表达系统进行异源表达,研究其酶学性质和还原剂对其活性的影响,进一步探讨LPMO与糖苷水解酶协同作用时的底物结合现象。【结果】Ao LPMO2和Ao LPMO5序列分析显示,两种蛋白都为辅助酶类9家族的LPMOs;电击转化至真核毕赤酵母GS115中,获得双拷贝转化子GS/AO5-4,经1%甲醇诱导4 d后,上清液蛋白表达量为0.19±0.01 g/L。重组蛋白分子量约34 k Da,高于理论分子量,推测可能存在翻译后修饰。酶学性质分析表明,Ao LPMO5对刺槐豆胶的最适反应温度和p H分别为60°C和5.0,Km和Vmax分别为8.72±1.99 mg/m L和109.4±12.8μmol/(s·mg)。0.1 mmol/L Cu^2+促进酶活性提高(7.10±1.32)%(P<0.05),0.5、2.0和2.5 mmol/L H2O2分别促进酶活性提高(21.11±6.17)%(P<0.01)、(20.22±1.13)%(P<0.01)和(18.40±2.86)%(P<0.01),而没食子酸和维生素C对活性无明显作用。在反应前期,Ao LPMO5与刺槐豆胶底物结合从而影响甘露聚糖酶Bs MAN3的降解作用。而在反应后期,Ao LPMO5与Bs MAN3则表现出协同增效作用。【结论】Ao LPMO5是一种全新的生物质降解酶,阐明其酶学性质和底物作用方式,将为天然木质纤维素类底物的高效转化与生物炼制,如第二代生物乙醇、功能性低聚寡糖等生产建立基础。

来源于真菌AA9家族裂解性多糖单加氧酶的研究进展

AA9家族的裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)广泛存在于真菌中,由于其能作用于木质纤维素的结晶多糖,从而使其在生物转化生物质方面发挥重要的作用。本文首先综述了AA9家族LPMO的结构特点、催化机制、结构与功能之间的关系,其次阐述了AA9家族LPMO的微生物表达与调控,最后简单介绍了AA9家族LPMO在转化木质纤维素中的应用。

LPMO结合硫酸水解制备纤维素纳米晶体

以棉溶解浆为原料,使用裂解性多糖单加氧酶(LPMO)预水解结合硫酸水解制备纤维素纳米晶体(CNC),对LPMO预水解前后纤维的微观形态和制得的CNC进行了粒径、结晶度和微观形态等表征,并与仅硫酸水解制备的CNC进行对比。研究发现,采用质量分数60%硫酸水解时,经LPMO预水解得到的CNC比仅硫酸水解制备的CNC平均粒径减少22 nm,结晶度提高8.8个百分点,得率提高19.3个百分点。在LPMO预水解后,随着硫酸质量分数降低,CNC的得率和羧基与磺酸基总量减少,粒径上升,而结晶度无明显正比关系。从LPMO作用整体效果来看,预水解结合50%硫酸得到的CNC与对照组相比粒径增加9 nm,羧基和磺酸基总量略小,而结晶度提高6.4个百分点,得率提高18.4个百分点,其原子力显微镜(AFM)表征显示已达到纳米水平。故通过LPMO预水解结合50%硫酸即可制得CNC,这可降低对工业生产上设备耐酸能力的要求。但LPMO反应周期长,因此在实际工业应用中有待进一步研究。