甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白基因异亮氨酸796缬氨酸多态性与冠心病、高脂血症的相关研究

目的 :研究湖北汉族人群甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白 (SCAP)基因异亮氨酸 (Ile) 796缬氨酸(Val)多态性 ,探讨该多态性与冠心病、高脂血症的关系。方法 :应用PCR RFLP的分析方法 ,检测 1 5 0名湖北汉族体检健康者、1 32例冠心病和 6 6例高脂血症患者SCAP基因Ile796Val的等位基因频率。结果 :①冠心病、高脂血症、对照组等位基因A的频率分别为 0 .4 5 ,0 .4 8,0 .32 ,等位基因G的频率分别为 0 .5 5 ,0 .5 2 ,0 .6 8。②冠心病、高脂血症与对照组之间的基因型和等位基因的频率差异均有显著性差异 (P <0 .0 5 )。③冠心病、高脂血症组内AA基因型的TC水平明显高于GG基因型的TC水平 (P <0 .0 5 )。结论 :SCAP基因Ile796Val多态性与冠心病、高脂血症密切相关。提示SCAP基因A等位基因与血浆高胆固醇有着密切的关系 ,可能是罹患高脂血症、冠心病的危险因子。

甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白基因异亮氨酸796缬氨酸多态性与血脂水平关系的研究

目的 研究湖北地区健康人群甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白 (SCAP)基因的异亮氨酸 (Ile) 796缬氨酸 (Val)多态性 ,并分析该多态性与冠心病、高血压的关联性 ,及其与脂质代谢之间的关系。方法 采用聚和酶链反应 限制性片段长度多态性的分析方法 ,检测 10 0名体检健康者和6 6例冠心病患者、5 7例高血压患者的Ile796Val的等位基因频率。结果 体检健康者和冠心病患者、高血压患者等位基因A的频率分别为 :0 .32、0 .45、0 .42 ,等位基因G的频率分别为 0 .6 8、0 .5 5、0 5 8,对照组和冠心病组之间的基因型和等位基因的频率差异均有显著意义 (P <0 .0 5 ) ,总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白 胆固醇 (LDL C)、载脂蛋白B(ApoB)水平差异亦存在显著性 (P <0 .0 1,P <0 .0 1,P <0 .0 5 ) ,冠心病组内的不同基因型的TC水平差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;高血压组虽然存在基因型的差异 ,A/G等位基因的频率和血脂水平差异均无显著意义 ,但是高血压组内不同基因型的TC、LDL C、ApoB水平差异有显著意义 (P <0 .0 5 )。结论 SCAP基因的Ile796Val多态性可能引起血脂水平和组织中脂质代谢的紊乱 。

肿瘤坏死因子α对肝细胞脂肪变性模型裂解激活蛋白表达的影响

目的探讨TNFα对油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）的表达及TG含量的影响。方法以正常肝细胞株L02进行细胞培养,用油酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型,在对照组（C组）及模型组（F组）中加入TNFα（C1组和F1组）与抗TNFα抗体（C2组和F2组）分组进行培养,采用RT PCR法检测SCAP mRNA的表达,Western blot检测SCAP蛋白的表达,采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化,并检测细胞内甘油三酯含量。结果TNFα作用组SCAP mRNA的表达上调,C1组比C组上调67%,F1组比F组上调55%,F-212.98,P〈0.01,差异有统计学意义。TNFα作用组SCAP蛋白的表达也上调,C1组比C组上调45%,F1组比F组上调95%,F-104.3,P〈0.01,差异有统计学意义。而使用抗TNFα抗体作用后表达显著下调,细胞内TG含量,对照组为（2.02±0.67）mg/10^7细胞,模型组为（7.79±1.35）mg/10^7细胞,模型组TNFα组为（13.36±1.99）mg/10^7细胞,F-82.94,P〈0.01,TNFα作用组较对照组脂变细胞数量增多,差异有统计学意义,而使用抗TNFα抗体作用后脂变细胞数量减少,细胞内TG含量显著下降。结论TNFα上调L02肝细胞SCAP的表达,促进细胞内TG的合成,可能参与了肝细胞脂肪变性的形成。

石蒜碱通过降解SCAP蛋白抑制口腔鳞癌细胞增殖与侵袭的实验研究

目的:探讨天然植物提取物石蒜碱对口腔鳞癌细胞的作用及相关机制。方法:应用平板克隆形成实验和流式细胞术检测石蒜碱对口腔鳞癌细胞体外增殖的作用,采用划痕实验和Transwell实验检测石蒜碱对口腔鳞癌细胞侵袭的作用,应用Western免疫印迹和免疫荧光验证石蒜碱对口腔鳞癌细胞SCAP蛋白的抑制作用。构建裸鼠荷瘤模型检测石蒜碱的体内抗口腔鳞癌效果。采用Graphpad Prism软件包进行统计学分析。结果:平板克隆形成和流式细胞实验显示,石蒜碱对口腔鳞癌细胞的体外增殖具有明显的抑制作用。划痕实验和Transwell结果显示,石蒜碱对口腔鳞癌细胞的体外迁移、侵袭也具有明显的抑制作用。Western免疫印迹和免疫荧光结果显示,石蒜碱能够降解口腔鳞癌细胞的SCAP蛋白,影响癌细胞的胆固醇代谢。动物实验结果进一步表明,石蒜碱在体内也具有良好的抗癌活性,能显著抑制口腔鳞癌细胞的生长,降低癌细胞内SCAP蛋白水平。结论:石蒜碱能够通过降解SCAP蛋白,抑制口腔鳞癌细胞增殖与侵袭,有望成为治疗口腔鳞癌的低毒高效天然植物提取药物。

炎症致巨噬细胞和血管平滑肌细胞低密度脂蛋白受体反馈调控差异的研究

目的：探讨在生理及炎症应激条件下，人单核细胞系（T HP-1）巨噬细胞和血管平滑肌细胞（VSMCs）、低密度脂蛋白受体（LDLr）的负反馈调控的细胞特异性差别及其可能的机制。方法脂多糖（LPS）加入T HP-1巨噬细胞和VSMCs培养基中诱导炎症应激，酶学法检测细胞内胆固醇水平，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测LDLr、SCAP、固醇调控元件结合蛋白2（SREBP2）mRNA水平。结果生理条件下，LDL负荷增加细胞内胆固醇水平，进而减少 THP-1巨噬细胞和 VSMCs LDLr mRNA 水平。VSMCs IC50为11．25μg/mL ，低于THP-1巨噬细胞的18．125μg/mL。0～400 ng/mL LPS 呈剂量依赖性上调两种细胞 LDLr mRNA 水平，但VSMCs LDLr曲线比THP-1巨噬细胞LDLr曲线平坦，200 ng/mL LPS处理下，THP-1巨噬细胞LDLr mRNA上调倍数远高于VSMCs（0．33和0．04）。LDLr阻断剂肝素钠减少两种细胞内由LPS诱导的胆固醇沉积。生理条件下，LDL负荷减少SREBP2和SCAP mRNA水平，而LPS增加SREBP2和SCAP mRNA水平。结论炎症应激在两种细胞中均扰乱细胞内胆固醇水平介导的LDLr负反馈调控，THP-1巨噬细胞LDLr上调程度更大，这可能是炎症应激下T HP-1巨噬细胞更易泡沫化的一个原因。

固醇调节元件结合蛋白的研究

细胞膜中的胆固醇浓度保持动态平衡有赖于固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)。SREBPs是DNA结合蛋白,当细胞内固醇减少时,SREBPs裂解激活蛋白(SCAP)能感受到,SCAP与SREBPs形成复合物,护送SREBPs从内质网到高尔基体,再经过两个顺序性的蛋白裂解,SREBPs的N端结构域从膜上释放出来,含有bHLH-Zip的该结构域进入到细胞核,与固醇调节元件相结合,进而激活编码胆固醇生物合成的酶和LDL受体基因的转录;当胞内固醇超载时,SCAP不再护送SREBPs到高尔基体进行蛋白裂解,核内SREBPs的N端结构域也发生降解,胆固醇合成停止。若此信号传导中任一环节有误,会导致体内固醇代谢紊乱,引起高脂血症。

奶牛乳腺上皮细胞中SCAP和SREBP1蛋白调控SCD基因表达的作用研究

旨在研究奶牛乳腺上皮细胞中固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)对固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)调控的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)表达的影响。培养奶牛乳腺上皮细胞,在细胞中转染奶牛SCD基因启动子载体,同时转染SREBP1和SCAP真核表达载体作为处理,采用双荧光素酶报告基因系统检测转染SREBP1和SCAP对SCD基因启动子活性的影响;采用免疫荧光技术观察SREBP1在细胞核的表达,采用荧光定量PCR检测SCD基因mRNA的表达。结果表明,与转染pcDNA3.1载体的对照组相比,转染SCAP对SCD启动子活性无显著影响;转染SREBP1和共转染SCAP/SREBP1极显著增加SCD基因启动子活性值(P<0.01),并且SCAP的转染剂量与SCD的启动子活性值之间具有极显著的量效关系(P<0.01);在乳腺上皮细胞中转染SCAP后,能够增强SREBP1在细胞核的表达;细胞转染SREBP1和共转染SCAP/SREBP1后,SCD基因mRNA的表达分别显著上调1.23倍和1.54倍(P<0.05)。本研究表明,奶牛SCAP可以增加SREBP1蛋白在细胞核中的表达,促进对SCD基因的转录激活作用。

炎症诱导SCAP功能失调促进ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的分子机制

目的探讨炎症诱导胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)功能失调促进ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化形成的分子机制。方法 24只8周龄雄性ApoE^(-/-)小鼠(C57BL/6遗传背景,体质量18~24 g)随机分组为高胆固醇饮食组(n=12,对照组)和高胆固醇饮食+炎症组(n=12,炎症组)。炎症组小鼠给予隔日皮下注射10%酪蛋白,非炎症组小鼠给予隔日皮下注射生理盐水,共14周。双抗夹心ELISA法检测ApoE^(-/-)小鼠血清炎症指标(serum amyloid A,SAA)和TNF-α水平,HE染色观察ApoE^(-/-)小鼠主动脉结构及局部炎症细胞浸润情况,油红O染色观察ApoE^(-/-)小鼠主动脉斑块形成情况,Real-time PCR法与免疫组织化学法检测ApoE^(-/-)小鼠主动脉LDLr、SREBP2、SCAP、α-甘露糖苷酶Ⅰ及α-甘露糖苷酶ⅡmRNA与蛋白表达。结果炎症组小鼠血清SAA[(529±23)ng/m L]与TNF-α[(37 900±3 100)ng/m L]水平显著高于对照组小鼠血清SAA[(248±27)ng/m L]与TNF-α[(1 789±219)ng/m L]水平(P<0.01),表明ApoE^(-/-)小鼠炎症模型建立成功。炎症组小鼠较对照组小鼠主动脉粥样硬化性病变更为严重(P<0.01),其LDLr、SCAP及α-甘露糖苷酶ⅡmRNA及蛋白表达、细胞核内NSREBP2水平明显高于对照组(P<0.05)。结论炎症通过增加血管壁细胞内胆固醇敏感器SCAP的表达,并通过增强高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ对SCAP的糖基化修饰,促进ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的发生和发展。

脂多糖通过LDLr诱导巨噬细胞泡沫化:炎症应激下巨噬细胞泡沫化的另一条通路

目的研究炎症介质-脂多糖(LPS)诱导的炎症应激是否通过扰乱固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白-固醇调节元件结合蛋白2(SCAP-SREBP2)复合物介导的低密度脂蛋白受体(LDLr)负反馈调控,增加THP-1巨噬细胞对非修饰低密度脂蛋白胆固醇(LDL)摄取,导致泡沫细胞形成。方法诱导分化成功的THP-1巨噬细胞在无血清培养基中培养4 h后,分为对照组(继续无血清培养),高脂组(加入LDL负荷,终浓度为25 mg·L-1),高脂加炎症刺激组(加入LDL负荷,终浓度为25 mg·L-1,同时加入炎症介质LPS,终浓度200μg·L-1),单纯炎症刺激组(加入炎症介质LPS,终浓度200μg·L-1),以上各组细胞培养24 h后收获。ELISA法检测细胞培养基中TNF-α浓度,酶化学法检测细胞内胆固醇浓度,琼脂糖电泳检测LDL氧化程度,Real time PCR法检测LDLr、SREBP2和SCAP mRNA表达水平,Western blot法检测LDLr、SREBP2和SCAP蛋白表达,激光共聚焦检测SCAP在内质网与高尔基体间的转位情况。结果细胞内胆固醇测定发现,炎症介质LPS通过增加THP-1巨噬细胞对非修饰LDL摄取,导致巨噬细胞转变为泡沫细胞。在无炎症介质LPS时,25 mg·L-1LDL减少LDLr mRNA和蛋白表达(P<0.05)。然而,LPS增加LDLr mRNA和蛋白表达,逆转25 mg·L-1LDL对LDLr的抑制效应,不恰当的增加了巨噬细胞对LDL摄取(P<0.05),LPS刺激也导致了SCAP和SREBP2的mRNA和蛋白过表达(P<0.05),同时促进了SCAP从内质网转移到高尔基体。这些结果提示LPS干扰了胆固醇介导的LDLr负反馈调控,使非修饰LDL在巨噬细胞内堆积,导致泡沫细胞形成。结论本研究提示,在LPS诱导的炎症应激状态条件下,天然LDL可以通过LDLr被巨噬细胞大量摄取入细胞内,导致泡沫细胞形成,这可能是巨噬细胞泡沫化的另一条通路。

缺血性心脑血管疾病患者SCAP基因Ile796Val多态性的研究

目的 探讨甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白 (SCAP)基因 Ile796Val多态性与缺血性心脑血管疾病患者的相关性。方法 选取冠心病患者 1 1 2例分为 2组〔血清胆固醇 (TC)与甘油三酯 (TG)正常组 50例 ,血清 TC与 TG增高组 62例〕,缺血性脑卒中患者 53例。采用 PCR-RFLP的分析方法 ,检测老年人群中缺血性心脑血管疾病患者 SCAP基因 Ile796Val的多态性。结果 冠心病血脂正常组与对照组相比 ,基因型和等位基因差异无显著性 (P>0 .0 5)。冠心病血脂增高组和缺血性脑卒中组与对照组相比 ,基因型和等位基因均有显著性差异 (P<0 .0 5) ,且 A等位基因频率显著高于对照组。结论 SCAP基因 Ile796Val多态性对心脑血管的遗传学研究具有重要意义。提示 SCAP基因 A等位基因与动脉粥样硬化有着密切的关系 ,并且增加了罹患缺血性心脑血管疾病的风险性。

胆固醇敏感器SCAP功能失调对THP-1源性巨噬细胞炎症因子表达的影响

目的观察胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)功能失调对THP-1源性巨噬细胞脂质代谢及IL-1β、MCP-1表达的影响,探讨SCAP的促炎作用是否依赖于其介导的胆固醇稳态调节功能。方法采用基因转染方法在THP-1源性巨噬细胞中过表达SCAP或沉默SCAP,结合使用炎症刺激剂LPS(1μg/m L)或SCAP转位抑制剂Betulin(3μmol/L)处理THP-1源性巨噬细胞,将细胞分为对照组、过表达SCAP组、沉默SCAP组、LPS组、沉默SCAP+LPS组、Betulin组以及过表达SCAP+Betulin组,RT-PCR法检测过表达SCAP或沉默SCAP对HMGCo AR、pro-IL-1β、MCP-1基因表达水平的影响。油红O染色观察不同组别细胞内中性脂质沉积的变化。酶法定量测定胞内胆固醇含量。Western blot法检测SCAP、pro-IL-1β以及培养上清中IL-1β的蛋白水平。结果 1过表达SCAP组与对照组比较,其HMGCo AR、MCP-1、proIL-1β基因表达水平升高(P<0.01),细胞内pro-IL-1β及细胞培养上清中IL-1β蛋白含量均上升(P<0.05),且细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)及胆固醇酯(cholesterol ester,CE)含量上升(P<0.01)。2沉默SCAP组与对照组比较,HMGCo AR、MCP-1、pro-IL-1β基因表达水平下降(P<0.05),细胞内proIL-1β及培养上清中成熟IL-1β蛋白含量均降低(P<0.05),且细胞内中性脂质蓄积减少,TC及CE含量下降(P<0.05);沉默SCAP+LPS组与LPS组比较,MCP-1、pro-IL-1β基因表达下调(P<0.05),成熟IL-1β蛋白水平下降(P<0.05)。过表达SCAP+Betulin组与过表达SCAP组比较,HMGCo AR基因表达水平下降(P<0.05),其细胞内,TC及CE含量亦下降(P<0.05),但MCP-1、pro-IL-1β基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05),培养上清中成熟IL-1β蛋白含量差异也无统计学意义(P>0.05)。结论胆固醇敏感器SCAP功能失调促进THP-1源性巨噬细胞内炎症因子IL-1β、MCP-1表达,增加成熟IL-1β的生成及其向细胞外分泌;SCAP这一新发现的功能不依赖于其介导的胆固醇稳态调节功能。

山楂酸减少L02细胞脂质累积作用的研究(英文)

非酒精性脂肪性肝在发达国家和发展中国家中是一种常见的肝脏疾病。引起非酒精性脂肪性肝病的最常见原因有肥胖、糖尿病和高胆固醇。尽管非酒精性脂肪性肝病的发病率日益升高,事实上至今尚未发现可以用于治疗的药物。山楂酸是一种五环三萜化合物,已报道具有多种药理特性,包括抗炎、抗氧化以及免疫调节作用。我们的前期研究表明,山楂酸能够抑制高脂饲料诱导大鼠非酒精性脂肪性肝病的生成。本研究中,我们将探讨山楂酸体外对肝细胞(LO2)脂质累积的抑制作用。结果表明,山楂酸可抑制游离脂肪酸(FFA)诱导的LO2细胞脂质累积,进一步研究表明,山楂酸可抑制LO2细胞的SCAP mRNA水平和蛋白水平的表达。

SCAP与胆固醇水平的调节机制

ＳＲＥＢＰ裂解激活蛋白(ＳＲＥＢＰ ｃｌｅａｖａｇｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＳＣＡＰ)是哺乳动物脂质合成和摄入的中心调节因子。在胆固醇代谢的反馈调节系统中,ＳＣＡＰ与膜结合转录因子胆固醇调节元件结合蛋白(ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ;ＳＲＥＢＰｓ)等调节因子,共同控制一系列酶编码基因的转录过程,包括胆固醇和脂肪酸生物合成过程中所需的酶。作者介绍了ＳＲＥＢＰ的结构、分类和功能及其二步蛋白水解释放;ＳＣＡＰ的结构和作用机制及其在胆固醇水平调节中的作用;ＳＣＡＰ基因缺陷型及其胆固醇水平异常,并提出了尚待解决的问题。对ＳＣＡＰ的研究是胆固醇水平调节领域的一个新课题。

SCAP/SREBP2/LDLr通路在LPS诱导人血管平滑肌细胞泡沫化中的作用

目的:研究炎症介质——脂多糖(LPS)是否通过扰乱固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白-固醇调节元件结合蛋白2(SCAP-SREBP2)复合物介导的低密度脂蛋白受体(LDLr)负反馈调控,增加人血管平滑肌细胞对天然低密度脂蛋白胆固醇(LDL)摄取,导致泡沫细胞形成。方法:人血管平滑肌细胞在无血清培养基中培养24 h后,分为对照组(继续无血清培养);高脂组(加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml);高脂加LPS组(加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml,同时加入LPS,终浓度400 ng/ml);高脂加LPS加肝素组(加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml,加入LPS,终浓度400 ng/ml,加入肝素,终浓度5 mg/ml),以上各组细胞培养24 h后收获。酶化学法检测细胞内胆固醇浓度,油红O染色法检测细胞内脂质水平,Real time PCR法检测LDLr、SREBP2表达水平,细胞免疫化学法检测SCAP蛋白表达,激光共聚焦检测SCAP在内质网与高尔基体间的转位情况。结果:细胞内胆固醇测定及油红O染色发现,LPS通过增加人血管平滑肌细胞对非修饰LDL摄取,导致人血管平滑肌细胞转变为泡沫细胞。在LPS不存在时,25μg/ml LDL减少LDLr mRNA水平(P<0.05)。然而,LPS增加LDLr mRNA水平,逆转25μg/ml LDL对LDLr的抑制效应,不恰当的增加了血管平滑肌细胞对LDL摄取(P<0.05),LPS刺激也导致了SCAP蛋白表达增加和SREBP2的mRNA水平升高(P<0.05),同时促进了SCAP从内质网转移到高尔基体。这些结果提示LPS通过增加SCAP/SREBP2复合物从内质网到高尔基体转位,干扰了胆固醇介导的LDLr负反馈调控,使非修饰LDL在血管平滑肌细胞内堆积,导致泡沫细胞形成。结论:本研究提示,在LPS刺激条件下,SCAP/SREBP2/LDLr通路可能是血管平滑肌细胞泡沫化的另一条通路。

老年高脂血症患者SCAP基因单核苷酸多态性的研究

目的研究老年人群中甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)单核苷酸多态性,分析基因型及血脂水平与高脂血症之间的关联性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法 ,检测66例老年高脂血症患者(高脂血症组)和100例老年体检健康者(对照组)的SCAP基因Ile796Val的等位基因频率。结果高脂血症组、对照组等位基因A的频率分别为0.48、0.32,等位基因G的频率分别为0.52、0.68。高脂血症组与对照组之间的基因型和等位基因的频率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SCAP基因单核苷酸多态性导致脂质代谢紊乱,等位基因A可能是高脂血症的一个危险因子。

胆固醇敏感器SCAP功能失调通过上调P2X7受体表达促进THP-1源性巨噬细胞炎症小体活化

目的探讨胆固醇调节原件结合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)功能失调促进THP-1源性巨噬细胞炎症小体活化及IL-1β成熟的分子机制。方法采用基因转染方法在THP-1源性巨噬细胞中过表达SCAP,结合使用P2X7受体(P2X7 receptor,P2X7R)激动剂ATP(5 mmol/L)或抑制剂A438079(100μmol/L)处理THP-1源性巨噬细胞,将细胞分为:(1)对照组、(2)ATP处理组、(3)A438079处理组、(4)ATP+A438079组、(5)过表达SCAP组、(6)过表达SCAP+ATP组、(7)过表达SCAP+A438079组、(8)过表达SCAP+ATP+A438079组。RTPCR检测过表达SCAP以及激动或抑制P2X7R对P2X7R、pro-IL-1β、NLRP3、pro-caspase-1基因表达水平的影响。流式细胞术检测细胞表面P2X7R的表达。Western blot检测SCAP、pro-IL-1β、NLRP3、caspase-1(p20)以及培养上清中IL-1β的蛋白水平。同一实验在细胞水平重复4次。结果 (1)过表达SCAP组与对照组比较,其pro-IL-1β、P2X7R基因表达水平显著升高(P<0.01),细胞表面P2X7R表达明显上调。(2)P2X7R激动剂ATP与抑制剂A438079对THP-1源性巨噬细胞SCAP及P2X7R m RNA表达无影响(P>0.05)。P2X7R激动剂ATP能够显著促进THP-1源性巨噬细胞pro-IL-1βm RNA表达(P<0.05),在过表达SCAP基础上激动P2X7R能够进一步激活pro-IL-1β基因转录(P<0.01),同时显著促进细胞内pro-IL-1β剪切成熟并向细胞外分泌(P<0.01),抑制P2X7R活性并不影响过表达SCAP致pro-IL-1β表达上调的作用,但将减少上清中成熟IL-1β的含量。过表达SCAP并不影响NLRP3及caspase-1表达(P>0.05),但在过表达SCAP基础上充分激动P2X7R将显著上调NLRP3及caspase-1基因及蛋白水平(P<0.01),上述变化能够被P2X7R抑制剂A438079抵消。结论胆固醇敏感器SCAP功能失调能够促进THP-1源性巨噬细胞内pro-IL-1β表达,同时通过上调细胞表面P2X7R表达激活NLRP3炎症小体,促进pro-IL-1β成熟及其向细胞外分泌。

SCAP重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响

目的构建固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SRREBP cleavage activating protein,SCAP)基因干扰(small interfering RNA,siRNA)和过表达重组腺病毒,观察其对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响。方法应用pAd EasyTM腺病毒载体系统构建重组腺病毒质粒p Ad-SCAPsiRNA和p AdSCAP,在HEK293细胞中分别包装和扩增。RT-PCR和Western blot检测ATDC5细胞中SCAP的表达,流式细胞仪检测SCAP腺病毒对ATDC5细胞周期和凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、p-JNK的表达。结果成功获腺病毒si SCAP(滴度为2.5×10^(10)PFU/m L)和Ad-SCAP(滴度为3.0×10^(11)PFU/m L)。RT-PCR和Western blot结果表明:siSCAP和Ad-SCAP能分别有效抑制和增强ATDC5细胞中SCAP的表达。流式细胞仪检测结果表明:与正常组和空病毒组比较,si SCAP腺病毒处理组S期细胞比例升高15.45%和16.07%(P<0.05),Ad-SCAP组比例降低14.27%和13.45%(P<0.05);siSCAP组细胞凋亡率降低13.10%和11.50%(P<0.05),Ad-SCAP组升高10.51%和10.17%(P<0.05)。Western blot检测结果与流式细胞仪检测结果一致。结论成功构建SCAP腺病毒;敲低SCAP能促进ATDC5细胞增殖并抑制凋亡;过表达SCAP则抑制增殖、促进凋亡。

沉默SCAP基因对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响

旨在探究沉默固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响,本研究构建了SCAP短发夹RNA慢病毒载体,包装感染奶牛乳腺上皮细胞,通过在培养基中添加嘌呤霉素筛选获得SCAP基因沉默稳转细胞株,采用Real-time PCR和Western blot观察基因沉默细胞株中SCAP基因和蛋白的表达,尼罗河红和油红O染色脂滴检测SCAP基因沉默及SCAP质粒瞬时转染对细胞脂滴形成的影响。结果表明,本研究成功构建了奶牛SCAP基因沉默慢病毒重组载体,感染细胞后经过5 mg·L^(-1)嘌呤霉素筛选得到SCAP基因沉默稳转细胞株。基因检测发现,各个沉默细胞株的SCAP基因表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,RNAi-SCAP3细胞中的SCAP蛋白表达降低为对照组的0.49倍(P<0.05),脂代谢基因SCD和FAS表达也显著下降(P<0.05)。脂滴染色发现,RNAi-SCAP3沉默细胞株的脂滴含量显著低于对照组细胞(P<0.01),脂滴直径≤2.0μm的小脂滴个数增多,而直径≥2.5μm的大脂滴个数减少;将SCAP真核表达载体瞬时转染RNAi-SCAP3细胞株后发现,SCAP基因的过表达显著减少了细胞中小脂滴比例而增加了大脂滴比例(P<0.05)。本研究成功构建了SCAP基因沉默稳转细胞株,发现SCAP的表达影响了细胞脂滴直径的大小。

泌乳奶牛甘油三酯合成过程中潜在基因的诱导表达

就反刍动物而言,目前胆固醇代谢机理仍然不甚清晰。牛奶中的胆固醇浓度因奶牛品种、牛场管理、牛个体及泌乳周期的不同而存在较大差异。但遗传因素在胆固醇分泌进入牛奶过程中所起的作用还不清楚。因为反刍动物饲料中并不存在胆固醇,因此为了减少奶制品中胆固醇的含量,弄清它合成、转运、分泌进入牛奶的机理就显得尤为重要。目前的工作主要集中在研究泌乳期欧洲牛肝脏中对该过程起作用的潜在基因的表达。在不同的时间点(产前2周和产后0、2、4、8周)对16头瑞士褐牛进行肝脏穿刺,经过RNA抽提和反转录,用实时定量RT-PCR研究潜在基因的表达。胆固醇合成的关键酶(3-羟甲基戊二酰辅酶A合成酶、3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和法尼基二磷酸法尼基转移酶)及脂质代谢相关的基因表达反馈调节子(固醇调节元件结合蛋白SREBP1、2和裂解激活蛋白Scap)被认为是潜在基因。3-羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶和法尼基二磷酸法尼基转移酶(FDFT)基因在产后2周表达显著增加(P<0.01),极有可能是对乳腺新需求所产生的应答。另外,SREBP1和Scap表达量的增加也可以作为这种修饰的一种可能的解释(分别为P<0.01和P<0.05)。最重要的是,上述提到的所有酶的表达具有显著的正相关,所有的合成机理表明这些酶为协同调节酶。欧洲牛产后血液及奶中胆固醇水平的升高可能是肝脏中关键酶和调节因子表达的协同诱导所致。

Scap-Insig-2-25HC复合物与细胞内胆固醇水平的调控

固醇调节原件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)是调节细胞内固醇类物质水平的重要细胞核转录因子,通过负反馈机制维持细胞内固醇稳态.SREBP裂解激活蛋白(SREBP-cleavage activating protein,Scap)和胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene-2,Insig-2)、25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol,25HC)对SREBP激活、成熟及核转位具有重要调节作用.最近研究揭示了Scap-Insig-2-25HC复合物的分子结构,这对细胞内胆固醇代谢研究具有重要的意义.