小毛莨内酯对结核病人颗粒裂解肽基因表达的作用

目的 研究小毛莨内酯 (Ternatolide ,Tern)对健康成人 ,初诊未治、耐药肺结核病人及儿童结核患儿周围血淋巴细胞 (PBL)体外活化后颗粒裂解肽 (granulysin ,GLS)mRNA表达的作用 ,探索其抗结核菌的分子免疫学机理。方法 采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern对以上 4组人群PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern在 10 0mg·L-1,2 0 0mg·L-1浓度时 ,均能诱导以上 4组人群体外活化的PBLGLSmRNA的表达 ,且各组诱导表达水平无显著差异。结论 Tern可能是通过提高CTL的效应分子GLSmRNA表达的水平 ,杀灭胞内致病菌MTB ,其诱导作用呈现剂量依赖性。

颗粒裂解肽G13结构域的表达及其对大肠杆菌活力的影响

目的构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达目的蛋白,并检测其对大肠杆菌活力的影响。方法人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPOThioFusion表达载体连接。通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体。结果工程菌经诱导,表达出相对分子质量约15000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的3%左右。随着外源蛋白的表达,菌液A600值下降,随后又缓慢上升。提取的质粒测序结果表明,其启动子的-35区和-10区均发生了突变,随着诱导时间的增加,突变细胞的比例不断增加。结论已成功构建了G13结构域原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白。该异源蛋白的表达导致工程菌的活力降低。

颗粒裂解肽G13结构域的重组表达及蛋白质结构预测

基因工程构建表达是获得抗菌肽的一种成本较低的方法,本实验人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPO ThioFusion表达载体连接,通过PCR鉴定筛选出正确重组质粒,在大肠杆菌Top10中对目的蛋白进行表达,大肠杆菌工程菌经阿拉伯糖诱导后取样,用SDS-PAGE检测表达情况,采用生物信息学方法对表达蛋白的结构特征进行模拟分析。结果显示:目的蛋白在原核系统中实现了高效表达,表达量高达67%以上,主要以包涵体形式表达。蛋白结构预测结果显示,目的蛋白原有的α螺旋活性结构无改变,从而为抗菌肽高效生产提供了有效可靠的研究途径。

结核杆菌的克星——颗粒裂解肽

目的 介绍国外有关治疗结核病新药研究的进展。方法 综述国外文献。结果 颗粒裂解肽在细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK激活晚期被诱导表达。颗粒裂解肽的基因编码 3种mRNA ( 5 19,5 2 0 ,5 2 2 ) ,两种肽 ( 90 0 0 ,15 0 0 0 ) ,15 0 0 0的经翻译后修饰为 90 0 0 ,含一个alpha helix和一个二硫键的 2 2氨基酸肽段为抗结核杆菌的结构域。天然颗粒裂解肽和重组颗粒裂解肽都具有广谱抗菌活性 ,尤其是能杀死结核杆菌。

利用自裂解肽T2A共表达猴B病毒糖蛋白gB和gD

目的:探讨自裂解肽T2A对猴B病毒g D和g B蛋白共表达的可行性。方法:利用一点褐翅蛾病毒(Ta V)的2A元件(T2A)连接猴B病毒膜蛋白g D和g B基因,构建多顺反子表达质粒,制备CHO-S工程细胞,采用Western印迹和ELISA检测蛋白表达及重组蛋白的免疫学特性。结果:g D和g B蛋白实现了共表达且保持了独立和完整的分子结构,但g B的表达水平明显低于g D;ELISA结果显示,单独表达的g D和g B以及共表达产物都能与B病毒阳性血清反应,但共表达产物的反应强度高于单独表达的g D和g B;重组蛋白经变性处理后,g B蛋白的吸光度值降幅最大。结论:自裂解肽T2A能够实现不同分子共表达且保持独立和完整的分子结构;共表达猴B病毒g D和g B分子有利于提高抗体检测的敏感性。

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的:建立颗粒裂解肽(NKG5)的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论:获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基因的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Ser的编码序列,克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T-1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量(Mr)为35 kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。

颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

为高效表达颗粒裂解肽G13结构域并避免G13对宿主菌的毒性,将人工合成的编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pThioHisA中,构建了重组表达载体pThioHisA-G13,将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白Trx-G13,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量约占细菌总蛋白的58%。包涵体蛋白经8 mol/L尿素溶解后,再经CNBr切割,阳离子交换层析,得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。

猫爪草对肺结核患者外周血淋巴细胞颗粒裂解肽表达及其T淋巴细胞杀菌能力的影响

目的研究猫爪草对肺结核患者外周血淋巴细胞颗粒裂解肽表达的影响及其对肺结核患者机体细胞毒性T淋巴细胞杀菌能力的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测猫爪草对外周血淋巴细胞作用的最适浓度;Real-time PCR方法检测最适剂量的猫爪草对结核病人外周血淋巴细胞颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 MTT结果显示,当猫爪草的作用浓度为100mg·L^(-1)时,有很明显的诱导作用,能诱导结核菌表达,外周血淋巴细胞颗粒裂解肽(GLS)的表达升高,进而感染结核病人体内的结核菌;当药物浓度浓度为200 mg·L^(-1)时能高效诱导结核休眠菌活化,外周血淋巴细胞GLS mRNA的表达持续升高,对结核菌的杀伤能力更强。结论猫爪草可能通过提高颗粒裂解肽的表达,增强机体对致病菌的杀伤作用,从而达到治疗效果。

大枣多肽裂解液抗肿瘤作用研究

目的:探讨大枣多肽裂解液抗肿瘤作用并初步探讨其抗肿瘤机制,为其临床应用提供实验室依据。方法:将接种肿瘤后的小鼠随机分为5组,每组10只小鼠,雌雄各半,给药10d,停药后24h处死动物,称小鼠体重,剥离小鼠右腋下皮下组织,摘出肿瘤,称瘤重,测定生化指标。结果:对肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)细胞荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用,其中对S180作用显著,较低剂量即可显示明显作用,延长S180荷瘤鼠生存时间;同时可增加吞噬指数α、廓清指数K、及胸腺系数;对体外淋巴细胞转化功能亦有增强作用。结论:大枣多肽裂解液具有明显抗肿瘤活性。

利用自裂解多肽T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因共同表达

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细胞,以FACS检测GFP基因的表达,RT-qPCR检测GFP、T2A和Neo的表达。结果:由T2A连接的GFP和Neo基因在mRNA水平上都有显著表达,且表达水平相当。结论:以T2A连接的基因在转入细胞后能正常翻译和表达,显示T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能,可作为一种构建多顺反子载体的有效工具用于牛耳皮肤成纤维细胞的基因转移,为其将来在转基因牛研制中的应用奠定了基础。

电裂解大豆肽抗疲劳作用的实验研究

实验观察电裂解大豆肽对小鼠抗疲劳作用的影响。电裂解大豆肽分为高、中、低剂量组,分别为7.5、5.0、2.5g/kg.d喂饲小鼠30d,观察小鼠爬杆时间、负重游泳时间,测定血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量,测定游泳前后0～20min内血清乳酸含量的变化。实验结果表明电裂解大豆肽能显著延长小鼠爬杆时间和负重游泳时间,增加小鼠运动过程中肝糖原和肌糖原含量,减少血清尿素氮的含量,并能显著降低游泳后血清乳酸的增加量。结论为电裂解大豆肽具有明显的抗疲劳作用。

基于多肽均相裂解电化学发光法检测前列腺特异性抗原

以前列腺特异性抗原(PSA)为目标分析物,多肽(CHSSKLQK)为分子识别物质,钌联吡啶衍生物作为信号物质,建立了基于金纳米粒子(AuNPs)均相电化学发光法检测PSA的新方法。利用多肽末端上的巯基将肽自组装在AuNPs上,当PSA加入含有多肽结合的AuNPs悬液中时,PSA选择性地切断信号物质标记的多肽。被切断的信号物质多肽片段离开AuNPs表面,离心分离后检测到的电化学发光强度与PSA质量浓度的对数在5. 0×10^(-12)~1. 0×10-9g/m L范围内呈良好的线性关系,检出限为2. 0×10^(-12)g/mL。用于血清样品的测定,该法的测定结果与化学发光免疫分析法基本一致,具有灵敏度高、重现性好等优点,为高灵敏检测蛋白酶提供了新思路。

多肽抗生素研究进展

多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽 ,一般具有抗细菌或真菌的作用 ,有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。按照化学结构的不同 ,多肽抗生素可分为5类 :①具有螺旋结构的线性多肽 ;②富含某种氨基酸的线性多肽 ;③含有一个二硫键的多肽 ;④含有两个或两个以上二硫键的多肽 ;⑤羊毛硫抗生素。根据作用机理的不同 ,多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。多肽抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面 ,并且有着很大的发展潜力。

靶向融合肽IL-4Rα-lytic对原发性渗出性淋巴瘤的抑制作用

目的:探讨靶向融合肽IL-4Rα-lytic对卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)阳性原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞的体内外杀伤作用及其安全性。方法:应用MTT法检测IL-4Rα-lytic对KSHV阳性PEL细胞BCBL-1和BCP-1的杀伤能力。通过FCM检测IL-4Rα-lytic诱导KSHV阳性PEL细胞凋亡的情况。建立BCBL-1细胞小鼠移植瘤模型,连续3周(3次/周)腹腔注射IL-4Rα-lytic后,通过活体生物发光成像技术评估IL-4Rα-lytic对小鼠体内BCBL-1细胞移植瘤的抑制效果,并通过H-E染色和全血分析法检测其毒副作用。结果:靶向融合肽IL-4Rα-lytic在体外对两种KSHV阳性PEL细胞BCBL-1和BCP-1均有选择性杀伤作用(均P<0.01),并且可以在短时间内发挥杀伤作用(均P<0.01)。靶向融合肽IL-4Rα-lytic可诱导KSHV阳性PEL细胞BCBL-1和BCP-1凋亡(均P<0.05)。靶向融合肽IL-4Rα-lytic显著抑制BCBL-1细胞小鼠移植瘤的生长,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),并且无明显的器官毒性(均P>0.05),同时不会造成体质量异常(P>0.05)。结论:靶向融合肽IL-4Rα-lytic在体内外均显著抑制KSHV阳性PEL细胞的生长,且无明显毒副作用,有望为PEL的治疗提供一种新的治疗方案。

小毛莨内酯对结核休眠菌感染病人GLS mRNA表达的影响

目的 研究小毛莨内酯抗人体结核休眠菌感染的分子免疫学机理。方法 采用PCR方法检测结核病人PBLs中结核菌 16kDα 晶状体同源蛋白DNA阳性的 5 6例患者为本研究对象 ;采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern .对以上病人PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern .在 10 0mg L ,2 0 0mg L浓度时 ,能诱导结核休眠菌感染病人体外活化的PBLGLSmRNA的表达。结论 Tern .可能通过促进颗粒裂解肽mRNA的表达 ,增强机体CTL杀菌能力 ,达到抗结核休眠菌的作用。