基于CRISPR/Cas9系统构建裸鼹鼠HIF-1α基因敲除质粒及其功能验证

目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1~4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。结论成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。

衰老对裸鼹鼠肝组织的影响

目的通过选取不同年龄段的裸鼹鼠,比较肝组织在衰老进程中的变化。方法选取幼年裸鼹鼠(2年龄)、中年裸鼹鼠(10年龄)、老年裸鼹鼠(20年龄),采集血液,分离血清,检测肝功能4项。采集肝,测定肝指数。制作石蜡切片,经HE染色和Masson染色后,光学显微镜下观察肝组织形态结构。采用动物组织生化检测试剂盒检测肝组织丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平。结果与幼年组裸鼹鼠比较,中年组和老年组裸鼹鼠肝指数、血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和白蛋白(ALB)水平均无显著差异(P>0.05)。HE染色及Masson染色结果均显示各组裸鼹鼠肝组织结构完整,无病理变化。中年组裸鼹鼠肝组织中的MDA、T-AOC水平无显著差异(P>0.05),老年组裸鼹鼠肝组织中的MDA、T-AOC水平显著升高(P<0.05),两组裸鼹鼠肝组织GSSG水平均无显著差异(P>0.05)。结论裸鼹鼠肝组织在衰老进程中表现出一定程度的抗衰老能力,具体抗衰老机制有待深一步研究。

裸鼹鼠乳鼠心脏成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的建立裸鼹鼠乳鼠心脏成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定方法。方法选取出生1~3 d的裸鼹鼠乳鼠,在冰上分离出乳鼠心脏,用眼科剪将心脏剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块,采用胰蛋白酶和II型胶原酶先后消化法分离心脏成纤维细胞。在光学显微镜下观察心脏成纤维细胞形态特征变化,CCK-8法检测细胞增殖活性,蛋白质印迹和免疫荧光法检测细胞波形蛋白表达情况。结果酶消化法分离的心脏成纤维细胞原代培养4 h已经完全贴壁,36 h即可铺满整个35 mm培养皿。传代培养2~3 d时心脏成纤维细胞增殖活力最强,蛋白质印迹和免疫荧光均证实细胞表达波形蛋白。结论胰蛋白酶和II型胶原酶先后消化法分离裸鼹鼠乳鼠心脏成纤维细胞,可获得活力好且纯度高的心脏成纤维细胞。

裸鼹鼠的人工饲养繁育初步研究

目的探索裸鼹鼠的人工饲养和繁育方法。方法在科学的饲养管理和适宜的饲养环境下，采用全同胞兄妹交配的方法，观察统计裸鼹鼠的妊娠率、胎间隔、窝产仔数、离乳数和成活率。结果通过7对裸鼹鼠的繁育观察，表明裸鼹鼠能适应人工环境。雌雄鼠初次交配年龄为8～12月龄，第1胎妊娠率为71.43％；5只母鼠第1胎平均产仔数9．20±3．90只／窝，离乳数7．60±5．03只／窝，成活率为75．10％±42．49％；第2胎胎间隔89．00±19．53d、产仔数9．60±5．68只／窝、离乳数6．20±4．09只／窝，成活率为74．33％±34．19％；第3胎胎间隔99．60±17．17d、产仔数12．40±4．77只／窝、离乳数10．00±3．08只／窝，成活率为82．91％±16．70％。结论裸鼹鼠在人工环境适应后，繁殖性能大大提高，可以培育出实验动物化的裸鼹鼠。

裸鼹鼠肝脏显微结构与超微结构观察

目的 观察和分析裸鼹鼠肝脏的形态结构与组成.方法 采集裸鼹鼠肝脏经石蜡切片和苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察裸鼹鼠肝脏的显微结构,以及经冰冻超薄切片和染色后,通过透射电镜观察和分析裸鼹鼠肝脏脏的超微结构.结果 光镜观察发现裸鼹鼠肝脏血管管腔直径较大,而且血管数量丰富;肝细胞体积略大,胞质中没有聚集成簇的糖原成分,肝细胞成索状分布,其间血窦非常丰富,而胆管不发达;透射电镜观察发现裸鼹鼠肝细胞处于旺盛的细胞合成阶段,线粒体和内质网数量丰富,糖原含量较少,溶酶体和自噬体也很丰富.结论 裸鼹鼠肝脏具有旺盛的代谢功能、解毒能力、以及自我降解受损蛋白和细胞器的能力.

裸鼹鼠胸腺、脾脏及淋巴结解剖学、组织学与超微结构的初步观察

目的 探讨裸鼹鼠脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结的组织结构及超微结构特点.方法 分别取裸鼹鼠脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结组织进行HE染色和透射电镜观察.结果 裸鼹鼠胸腺退化明显,脂肪化程度较高;脾脏被膜和小梁较厚,脾小体较小,数量少,边界清晰;肠系膜淋巴结与C57BL/6J小鼠肠系膜淋巴结并无太大差异.结论 明确了裸鼹鼠脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结组织解剖学、组织学与超微结构特点,为今后裸鼹鼠开展相关研究奠定了基础.

裸鼹鼠与C57BL／6小鼠自噬调节的比较研究

目的比较裸鼹鼠与小鼠的自噬调节，以期为裸鼹鼠高自噬、抗癌、衰老缓慢等生物学特性的研究提供参考。方法利用电镜技术和蛋白印迹检测新生裸鼹鼠和C57BL／6小鼠肝脏和肺脏组织的自噬水平。自噬干扰裸鼹鼠成纤维细胞和小鼠成纤维细胞，24、48、72hCCK-8细胞计数法检测细胞的增殖情况，蛋白印迹检测各组细胞各个时间点Beclin1的表达水平。结果与C57BL／6小鼠比较，裸鼹鼠组织的LC3B表达显著较高。裸鼹鼠细胞对自噬抑制剂3-MA具有一定的耐药性，自噬诱导剂雷帕霉素对裸鼹鼠细胞的增殖抑制显著高于小鼠细胞。结论裸鼹鼠组织具有高自噬水平，应对外界的自噬抑制压力时，裸鼹鼠细胞的自身调节能力明显高于C57BL／6小鼠。

裸鼹鼠肺脏显微结构与超微结构观察

目的 观察和分析裸鼹鼠肺脏的形态结构与组成.方法 采集裸鼹鼠肺脏经石蜡切片苏木精-伊红染色,然后光学显微镜下观察裸鼹鼠肺脏的显微结构,以及经冰冻超薄切片和染色后,通过透射电镜观察和分析裸鼹鼠心脏的超微结构.结果 光学显微镜观察发现裸鼹鼠肺脏有类似支气管扩张和肺不张等病理变化,而且肺血管分布情况和支气管上皮细胞的形态和分布与小鼠有很大不同;透射电镜观察裸鼹鼠肺脏并没有支扩和肺不张的病理变化,肺泡上皮细胞有微绒毛,裸鼹鼠肺脏气血屏障有增厚现象.结论 裸鼹鼠肺脏呈幼态性发育,而且肺泡可根据机体代谢率和需氧量的不同而进行开启和关闭.

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及p53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H_2O_2刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-1实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果饥饿与H_2O_2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,real-time PCR及Western blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、m TOR等表达量下降。结论 Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H_2O_2刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。

裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠肾脏组织结构及超微结构比较

目的 比较新型实验动物裸鼹鼠与常用啮齿类实验动物小鼠肾脏的组织结构和超微结构的差异.方法 采用成年裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠,处死后取肾脏,制作组织标本和电镜标本,利用光学显微镜和透射电镜观察其结构.结果 与C57BL/6J小鼠比较,裸鼹鼠肾小管上皮较薄,肾脏皮、髓质内存在较多的病理性钙化灶;肾小管上皮细胞内线粒体出现扩张甚至崩解,内质网扩张明显.结论 裸鼹鼠肾脏组织在结构上与C57BL/6J小鼠存在明显差异;裸鼹鼠肾小管上皮存在渐进性病理损伤,同时也存在较强的自我修复能力.

裸鼹鼠心脏显微结构与超微结构观察

目的 观察和分析裸鼹鼠心脏的形态结构与组成,以了解裸鼹鼠心脏是否在耐受低氧、长寿以及对抗心血管类疾病等方面有独特功能.方法 采集裸鼹鼠心脏经石蜡切片后进行苏木精-伊红染色,然后光学显微镜下观察裸鼹鼠心脏的显微结构,以及经冰冻超薄切片和染色后,通过透射电镜观察和分析裸鼹鼠心脏的超微结构.结果 光学显微镜观察发现,裸鼹鼠心脏体积较小鼠大,心壁也明显较厚,心肌细胞体积也略大,血管分布更为丰富广泛;透射电镜观察显示,裸鼹鼠心肌中线粒体较小鼠丰富,而体积较小,线粒体结构正常,但肌小节略有类似缺血的病变.结论 裸鼹鼠长期低氧的洞道生活史使其心脏形态结构发生了许多适应性变化,从而使其在对抗衰老和肿瘤方面有着独特的积极影响.

裸鼹鼠血液生理生化及尿常规值的测定

目的对裸鼹鼠进行血液生理指标、生化指标和尿常规值测定。方法采用全自动血细胞分析仪、生化测定仪及尿液分析仪对不同月龄、不同性别裸鼹鼠的血液学指标、生化指标值及尿常规值进行测定。结果得到了3月龄、6月龄和9周龄以及不同性别裸鼹鼠血液生理生化值与尿常规值；部分血液生理指标受性别及月龄影响较大。结论明确了裸鼹鼠部分血液生理生化及尿常规正常范围值，为今后裸鼹鼠研究奠定了基础。

裸鼹鼠生化位点的初步研究

目的研究裸鼹鼠（NMR）的生化位点特征，初步建立裸鼹鼠生化位点的检测方法。方法以小鼠近交系的生化位点为参照，应用小鼠的检测方法，检测裸鼹鼠的11种同工酶的活性。结果裸鼹鼠的酯酶-1、转铁蛋白为慢带；葡萄糖磷酸异构酶-1、苹果酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1为中间带；血红蛋白B链、肽酶-3、碱性磷酸酶-1、磷酸葡萄糖变位酶-1、酯酶-3、过氧化氢酶．2为快带。结论7只裸鼹鼠的11个生化位点为一致的条带，无多态性，表现为纯合型。

裸鼹鼠不同组织中低氧相关基因的表达

目的 检测幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中低氧相关基因的表达水平,分析裸鼹鼠耐低氧的分子机制.方法 分别提取幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中mRNA,采用RT-PCR方法检测低氧相关HIF-Iα、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF基因的表达.结果 成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中HIF-1α、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF的表达水平显著高于幼年裸鼹鼠.结论 裸鼹鼠体内低氧相关基因在不同年龄阶段表达水平不同.

裸鼹鼠生长发育指标及主要脏器系数正常参考值测定

目的测定不同周龄裸鼹鼠的生长发育指标及脏器系数正常参考值。方法以本中心近3年来饲养繁殖的裸鼹鼠为数据来源，测量其生长发育指标及脏器系数。结果裸鼹鼠生长发育过程中雌雄差异不明显。结论裸鼹鼠生长发育各项指标及脏器系数参考范围的确定为其实验动物标准化及实验应用提供重要参考数据。

裸鼹鼠成纤维细胞原代培养方法的建立

目的建立裸鼹鼠成纤维细胞的原代培养方法，研究裸鼹鼠成纤维细胞的生长特性。方法结合传统的消化培养法和组织培养法进行裸鼹鼠和小鼠成纤维细胞原代培养，CCK-8（cell countingkit）细胞计数比较研究两种物种成纤维细胞的生长速率和细胞周期。以不同浓度接种裸鼹鼠肝脏成纤维细胞，CCK-8计数细胞24h、72h、96h、144h细胞密度。结果结合消化培养法和组织培养法两种细胞原代培养方法，裸鼹鼠及小鼠成纤维细胞的生长状态良好。裸鼹鼠成纤维细胞的增殖速率显著高于小鼠成纤维细胞，处于对数生长期的细胞比例与小鼠比较，显著较高。以1．5×10^4／ml以上的浓度接种裸鼹鼠成纤维细胞能使细胞在两天内进入细胞生长对数期。结论结合消化培养法和组织培养法的原代培养方法能提高细胞原代培养的效率，裸鼹鼠成纤维细胞的增殖能力显著高于小鼠。

Poly I∶C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响

目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（Poly I∶C）对裸鼹鼠自噬水平的影响.方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I∶C给药组和对照组,分别腹腔注射Poly I∶C和生理盐水.Poly I∶C给药12h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况.结果 Poly I∶C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张;实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调（P＜0.05）,而C57BL/6小鼠则下调（P＜0.05）.结论 Poly I∶C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I∶C损伤的作用.

氯化钴诱导低氧对裸鼹鼠肝星形细胞增殖及凋亡的影响

目的 比较研究氯化钴（CoCl2）对裸鼹鼠及C57BL/6J小鼠肝星形细胞增殖和凋亡的影响.方法 采用活细胞计数试剂盒（CCK8）法和流式细胞术分别检测不同浓度CoCl2对裸鼹鼠和小鼠肝星形细胞增殖活力以及和凋亡水平的影响.采用蛋白印迹测定CoCl2处理后裸鼹鼠肝星形细胞低氧诱导因子1α（HIF-1α）和凋亡相关蛋白（BCL2、BAX）的表达水平.结果 低浓度（50 μtmol/L）CoCl2对C57BL/6j、鼠肝星形细胞增殖活性具有明显的抑制作用,并能显著提高其凋亡率,然而同样剂量的CoCl2能够显著提高裸鼹鼠肝星形细胞的增值活性,对细胞凋亡率亦无明显影响.高剂量CoCl2（＞200 μtmol/L）虽能导致裸鼹鼠肝星形细胞增殖活力的降低,及凋亡率的升高,但裸鼹鼠肝星形细胞的变化幅度明显小于小鼠.同时CoCl2处理后,裸鼹鼠肝星形细胞HIF-1α的表达或累积显著升高（P＜0.05）,BCL2/BAX比率显著上调（P＜0.05）.结论 与C57BL/6J小鼠相比,裸鼹鼠肝星形细胞具有更强的抵抗CoCl2引起的化学性低氧损伤的能力.同时HIF-1α可能参与调控裸鼹鼠抵抗化学性低氧环境造成的损伤.

裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究

目的 探讨多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（PolyI∶C）诱导下裸鼹鼠肺脏、肠组织的病理变化以及低氧诱导因子（HIF-1 α）和坏死因子（NF-κB）信号通路关键基因的表达水平,分析裸鼹鼠抵抗病毒可能的分子机制.方法 裸鼹鼠分为PolyI∶C处理组、生理盐水对照组.注射12h后处死动物,肺脏和肠组织切片经HE染色后观察病理变化;提取裸鼹鼠肺脏、肠组织中mRNA,采用半定量RT-PCR方法检测基因HIF-1 α、VEGFb（血管内皮生长因子b）、VEGF c（血管内皮生长因子c）、FLT-1（血管内皮生长因子受体1）、Fiz1（血管内皮生长因子受体3结合锌指蛋白1）、NKRF（转录因子NRF蛋白）的表达水平.结果 与对照组相比,PolyI∶C处理组的肺脏和肠组织病理变化不明显,而所检测基因的表达水平几乎都显著下降,仅肠组织中的FIZ1的表达水平有所上升（P＞0.05）.结论 PolyI∶C对裸鼹鼠没有产生明显的致病作用,它不能诱导裸鼹鼠体内HIF-1α和NF-κB信号通路活化,提示裸鼹鼠可能通过抑制相关信号通路的活性促使体内受感染的靶细胞迅速凋亡,从而清除入侵的病原体.

裸鼹鼠生物学特性的研究进展

裸鼹鼠是主要产于非洲肯尼亚、埃塞俄比亚等地的啮齿类动物,它诸多奇特的生物学特性为医学研究提供了一种新型应用面较广的实验动物,尤其是其在肿瘤、衰老、老年病、心血管病的发病机制研究和止痛药的研发方面更是有着无以伦比的优势,是近些年在国内外备受关注的一种新型实验动物.