褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化

为了提高来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脱色过氧化物酶(TfuDyP)对蒽醌染料降解能力,将含有目的基因的重组质粒pET-28a(+)-TfuDyP,转化至E.coli BL21进行异源表达,并对重组TfuDyP的发酵条件进行优化,分析酶活与血红素饱和度之间的关系。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测到分子质量为46 kDa的重组TfuDyP蛋白条带。TfuDyP的最佳诱导条件为:诱导剂(IPTG)浓度0.3 mmol/L,诱导时间14 h,诱导温度30℃,在此条件下,TfuDyP比酶活达到27.9 U/g。氯高铁血红素、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、谷氨酸(Glu)、FeCl2、MnCl2均可提高重组TfuDyP的催化活性,酶活的提高与血红素饱和度之间存在一定的正相关性。实验结果可为利用外源添加物提高血红素的饱和度,应用于染料脱色过氧化物酶的工业发酵提供理论依据。

以两阶段流加策略在大肠杆菌中生产褐色嗜热裂孢菌葡萄糖异构酶

为达到褐色嗜热裂孢菌葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的过量表达,褐色嗜热裂孢菌葡萄糖异构酶的编码基因被植入含有T7强启动子的表达载体p ET-24a(+)中,并转入重组大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,于3L发酵罐中采用两阶段补料策略进行高密度发酵产酶。在诱导前阶段,设定比生长速率μset=0.25,补料流加速率以指数方式增长;在诱导阶段,根据诱导后培养基中甘油残留量和乙酸的积累量,补料流加速率以梯度方式下降。在此流加策略下进一步考察影响发酵产酶的诱导强度、诱导节点、诱导温度和复合氮源的添加量等因素。最终根据两阶段流加策略,在乳糖流加速率0.2 g/(L·h),诱导时菌浓(DCW)30 g/L,诱导温度25℃和适量添加复合氮源的条件下,1 m L发酵液的菌体细胞内重组GIase产量达到124 U,这是通过菌体发酵产GIase获得的最高产量。

共表达谷氨酰-tRNA还原酶增强染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中的表达活性

染料脱色过氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶类,常因缺乏辅因子而导致催化活性低。将来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脱色过氧化物酶基因(TfuDyP)与大肠杆菌谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA),构建重组质粒phemA-DyP,转化至E.coli BL21中进行共表达。分别以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和顽固性染料活性蓝19(RB19)、溴酚蓝、溴甲酚绿为底物检测TfuDyP的催化活力以及染料脱色效率。结果表明,诱导后的共表达菌株pAD胞内血红素含量为9. 8μmol/L,而单独过表达基因TfuDyP的菌株pD仅为3. 4μmol/L。TfuDyP纯酶的全波长扫描分析表明,在菌株pAD中DyP酶与血红素的结合度相比pD有较大幅度的提升。pAD菌株表达的DyP酶活力较pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脱色应用方面也得到增强。在pAD菌株培养基中分别添加谷氨酸(Glu)、FeCl2使得胞内血红素含量、DyP酶活力和染料脱色效率比未添加时进一步提高。以上结果为TfuDyP的功能开发奠定了基础,同时也为其他血红素依赖性过氧化物酶的研发提供借鉴。