褪黑素在小鼠脊髓背角神经元发挥镇痛效应的受体机制研究

目的研究神经病理性痛状态下,褪黑素(MLT)是否在脊髓水平参与镇痛效应的调节及其可能的受体机制。方法采用雄性C57BL/6小鼠,进行坐骨神经部分损伤(SNI)模型及假手术(Sham)造模,7 d后鞘内分别给予MLT以及MLT不同受体激动剂和/或拮抗剂,运用von Frey丝测试比较SNI组及Sham组给药前后小鼠机械刺激缩足反应阈值,即机械痛阈值的变化。以雄性C57BL/6和转基因小鼠为研究对象,采用免疫荧光染色技术明确不同类型脊髓背角神经元上MLT受体的表达情况。通过膜片钳技术比较SNI造模及Sham术药物干预前后,脊髓背角神经元兴奋性的改变。结果与Sham组相比,SNI组小鼠的机械痛阈值明显降低(P<0.05);鞘内给予MLT和Ramelteon(MT1/MT2受体激动剂)均能显著恢复SNI组小鼠的机械痛阈值(P<0.05),但同时给予Ramelteon+4PP(MT2受体拮抗剂)后SNI组小鼠的机械痛阈值未恢复。免疫荧光结果表明,MT2广泛分布于小鼠脊髓背角的兴奋性神经元。膜片钳实验发现,与Sham组相比,SNI组脊髓背角兴奋性神经元的动作电位基强度明显降低(P<0.05),静息电位绝对值减小(P<0.05),并且MT2受体激动剂(8MP)可以逆转上述变化(P<0.01)。结论神经病理性痛状态下,MLT在脊髓水平显著缓解SNI小鼠的机械性痛敏,且其镇痛效应是通过MT2介导的。

电针通过褪黑素受体2抑制脊髓背角星形胶质细胞分泌IL-17对神经病理性痛大鼠产生镇痛作用

目的:观察褪黑素(Mel)受体2(MT2)是否参与电针对神经病理性痛大鼠的镇痛作用,以脊髓背角星形胶质细胞分泌白细胞介素17(IL-17)为研究切入点,探讨其可能机制。方法:先将18只大鼠分为假手术组、模型组、电针组,每组6只。采用坐骨神经慢性压迫法(CCI)制备大鼠神经病理性疼痛模型。电针组在造模后第7天电针"足三里""三阴交"。在造模前、造模后第7天和电针后60 min时检测大鼠患肢机械痛阈值(MWT)和热敏痛阈值(TPT);采用Western blot法检测脊髓背角MT2表达量,ELISA法检测Mel和IL-17含量,Western blot法和免疫组织化学法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达量。再将30只大鼠分成假手术组、模型组、电针组、MT2拮抗剂(4-P-PDOT)组、二甲亚砜(DMSO)组,每组6只。4-P-PDOT组和DMSO组大鼠在电针前30 min分别鞘内注射10μL MT2拮抗剂4-P-PDOT(100μg)和10μL DMSO。检测大鼠患肢MWT和TPT;Western blot法和免疫组织化学法检测脊髓背角GFAP表达量,ELISA法检测IL-17含量。最后将30只大鼠分成假手术组、模型组、电针组、重组IL-17组、生理盐水组,每组6只。在电针前30 min,重组IL-17组和生理盐水组大鼠分别鞘内注射10μL重组IL-17蛋白(100 ng)和10μL 0.9%氯化钠溶液。检测各组大鼠患肢MWT和TPT。结果:造模后第7天,模型组及电针组大鼠MWT较造模前明显升高(P<0.05),TPT较造模前明显下降(P<0.05)。在电针后60 min时,与模型组比较,电针组MWT明显下降(P<0.05),TPT明显升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠脊髓背角GFAP表达量和IL-17含量明显增加,Mel含量和MT2表达量明显减少(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠脊髓背角GFAP表达量和IL-17含量明显减少(P<0.05),Mel含量和MT2表达量明显增加(P<0.05)。与电针组和DMSO组比较,4-P-PDOT组大鼠MWT明显升高(P<0.05),TPT明显下降(P<0.05),GFAP表达量和IL-17含量也明显增加(P<0.05)。与电针组和生理盐水比较,重组IL-17组大鼠MWT明显升高(P<0.04),TPT明显下降(P<0.05)。结论:电针可增加CCI大鼠脊髓背角Mel含量和MT2表达量,抑制脊髓背角星形胶质细胞激活和IL-17释放。4-P-PDOT可逆转电针抑制CCI大鼠脊髓背角星形胶质细胞激活和IL-17释放,同时4-P-PDOT和重组IL-17可逆转电针对CCI大鼠的镇痛作用。推测电针可能是通过MT2抑制星形胶质细胞释放IL-17,从而对CCI大鼠产生镇痛作用。

MT2受体介导褪黑素对小鼠前胃癌细胞的抑制作用

目的探讨褪黑素(MLT)通过褪黑素膜受体MT2抑制小鼠前胃癌(MFC)细胞增殖及其与丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-Akt信号通路的关系。方法应用siRNA技术沉默MT2表达,观察褪黑素对小鼠前胃癌细胞的抑制作用及ERK1/2、Akt的磷酸化的影响。结果 1.siRNA介导的MT2沉默能明显拮抗褪黑素对胃癌细胞增殖的抑制作用;2.沉默MT2可部分阻断褪黑素抑制ERK1/2、Akt磷酸化的作用。结论褪黑素可通过MT2受体抑制ERK1/2、Akt的磷酸化从而抑制胃癌细胞增殖。

褪黑素MT2受体激动剂IIK-7对骨癌大鼠产生镇痛作用

目的:研究褪黑素MT2受体激动剂IIK-7对骨癌疼痛(bone cancer pain,BCP)大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的影响。方法:将30只180~220 g清洁级雌性SD大鼠随机分为5组(n=6):空白对照组(CONT组)、假手术组(Sham组)、骨癌痛组(BCP组)、IIK-7组及DMSO组。CONT组不做任何处理;Sham组大鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射10μL PBS液,鞘内置管,术后第3天开始鞘内连续输注DMSO(1μL/h,10 h);BCP组大鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射10μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液,连续输注DMSO(1μL/h,10 h);IIK-7组大鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射10μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液,术后第3天开始鞘内连续输注IIK-7(1μL/h,0.5μg/μL,10 h);DMSO组大鼠左侧后肢胫骨骨髓腔内注射10μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液,术后第3天开始鞘内连续输注DMSO(1μL/h,10 h)。用Von Frey纤毛测痛仪测定术前及术后第7、14、21天各组大鼠左后肢MWT;X线拍摄检测大鼠左后肢骨癌模型建立情况。结果:影像学结果显示,骨癌痛大鼠(BCP组)术侧胫骨骨皮质不连续,骨小梁缺失,周围组织明显肿胀。术前,各组大鼠术侧后肢MWT比较,差异均无统计学意义(P>0.05);术后第7、14、21天,CONT组与Sham组术侧后肢MWT较术前均无明显变化(P>0.05),但BCP组大鼠术侧后肢MWT均较CONT组明显降低(P<0.05);术后第7天,IIK-7组大鼠术侧后肢MWT与BCP组比较,差异无统计学意义(P>0.05),术后第14、21天,IIK-7组大鼠术侧后肢MWT较BCP组均明显升高(P<0.05)。结论:褪黑素MT2受体激动剂IIK-7可以提高骨癌痛大鼠MWT,缓解骨癌大鼠的疼痛。

成人肝癌组织褪黑素受体的表达和结合特性

目的检测成人肝癌组织是否表达褪黑素受体(me-latonin receptor,MR),并探讨其结合特性。方法免疫组化法检测肝癌组织MR两种亚型(MT1、MT2)的表达和分布。采用放射配体结合法检测肝癌组织MR特异性结合和动力学特性。结果免疫组化结果显示,成人肝癌组织MT1和MT2均呈聚集型粽黄色颗粒阳性染色,主要分布在细胞膜和细胞质,细胞核中表达最少。放射配体结合结果表明,成人肝癌组织存有125I标记的褪黑素(125I-Mel)特异结合位点,最大结合容量(Bmax)值为(0.29±0.07)pmol.g-1 protein,平衡解离常数(Kd)值为(48.7±6.5)pmol·L-1,动力学分析表明该特异性结合特点为可饱和及可逆性结合。结论成人肝癌组织表达MR,包括MT1和MT2,其结合特性为低结合容量、高亲和力、可饱和性及可逆性。