西农萨能奶山羊ATF4基因克隆及其功能初步研究

转录激活子4(activating transcription factor 4,ATF4)是ATF/cAMP应答元件结合蛋白,在反刍动物的生长发育起着关键作用。本研究旨在分析西农萨能奶山羊ATF4基因序列结构,通过siRNA技术干扰ATF4基因表达,初步探究其对奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢和乳蛋白合成的影响。为明确ATF4在西农萨能奶山羊不同组织的表达差异,采集西农萨能奶山羊不同泌乳时期乳腺组织,克隆得到ATF4基因的CDS区并进行生物信息学分析及组织表达谱分析。结果表明,克隆得到奶山羊ATF4基因CDS区,全长为1059 bp,其编码352个氨基酸,蛋白分子量为38.54524 ku,理论等电点为4.61,有35个丝氨酸磷酸化位点,为无跨膜结构的酸性蛋白质;西农萨能奶山羊ATF4蛋白的二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲、β-转角分别为39.77%、7.10%、51.14%和1.99%;ATF4与CEBPB、CEBPG、ATF3、FOSL2、ATF1、DDIT3、TRIB3、BTRC、CREB1、DISC 10个蛋白存在相互作用,与绵羊和牛的亲缘关系最近,同源性分别为97.45%和91.48%。组织表达谱分析结果表明,ATF4基因的表达量在瘤胃组织中最高,其次为肌肉。ATF4基因在泌乳前期表达水平最高,在泌乳盛期次之。干扰奶山羊乳腺上皮细胞ATF4基因表达,显著下调FASN、FABP3和BLG基因mRNA水平,上调PPARA、PPARG和LALBA基因mRNA水平。上述结果提示,ATF4基因可能参与奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢和乳蛋白合成过程。本研究为ATF4调控羊奶乳脂代谢和乳蛋白合成的分子机理提供了理论基础。

西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定

【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2640bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90%以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1040—-340bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。

西农萨能奶山羊IGFBP3基因多态与产羔数、体尺性状的关联分析

为了研究山羊IGFBP3基因多态及其与繁殖、生长发育性状的关系,利用HaeⅢ、TaqⅠ、Alw26Ⅰ和XspⅠ限制性内切酶分析了74只西农萨能奶山羊IGFBP3基因RFLP,并利用最小二乘分析法研究了其多态性与产羔数、初生质量、成年质量、体尺性状的关联性。结果表明,仅在XspⅠ位点发现西农萨能奶山羊群体表现多态性,存在GG、GA和AA 3种基因型,G等位基因频率为0.6825,A等位基因频率为0.3175,处于Hardy-Weinberg平衡状态。西农萨能奶山羊IGFBP3-XspⅠ基因座不同基因型与第2胎产羔数存在显著相关(P<0.05),且与初生质量也存在显著相关(P<0.05),GG基因型个体初生质量显著高于AA、GA基因型个体(P<0.05)。表明西农萨能奶山羊群体IGFBP3基因存在XspⅠ位点多态,且该位点对产羔性状和初生质量有显著影响。

PRLR基因外显子10多态性与西农萨能奶山羊产奶性能的相关分析

设计4对引物,采用PCR-SSCP技术检测催乳素受体(PRLR)基因外显子10在西农萨能奶山羊群上的单核苷酸多态性,同时研究该基因对其产奶性能的影响。结果表明:引物P2、P3与P4扩增片段具有多态性,P1的扩增片段不存在多态性。应用P2扩增片段,在西农萨能奶山羊中仅检测到AA和AB基因型,纯化测序表明AA与AB基因型相比有2处突变,C27T的突变没有导致氨基酸变化,第189处的碱基缺失导致氨基酸由组氨酸变为酪氨酸和苏氨酸。AA和AB基因型之间产奶量的最小二乘均值差异显著(P<0.05),AA基因型在各胎次产奶量和平均产奶量等指标上均高于AB基因型,其中第3胎的产奶量达到显著水平(P<0.05);应用P3扩增片段,在西农萨能奶山羊中检测到3种基因型(CC、CD、DD),纯化测序表明CC与DD基因型相比有2处突变(C103A和T106C),分别导致氨基酸由赖氨酸变为苏氨酸、苏氨酸变为异亮氨酸;3种基因型之间产奶量的最小二乘均值差异不显著(P>0.05)。应用P4扩增片段,在西农萨能奶山羊中也只检测到EE和EF基因型,纯化测序表明EE与EF基因型相比有1处突变(A114G),该突变导致氨基酸由蛋氨酸变为缬氨酸;EE和EF基因型之间产奶量差异显著(P<0.05)。EE基因型的个体各胎次产奶量均比EF型高,其中在第3、4胎产奶量和前4胎平均产奶量3项指标上都达到显著水平(P<0.05)。研究结果提示:PRLR基因对奶山羊产奶量有显著影响,因此认为PRLR基因外显子10位点可作为奶山羊高产奶量的标记辅助选择的有效分子标记。

CSN1S2、CSN3和β-lg基因对西农萨能奶山羊产奶性能的影响

利用PCRRFLP技术对69只西农萨能奶山羊群体的CSN1S2基因、CSN3基因和βlg基因多态性与产奶性状的相关性进行了研究。结果表明,CSN1S2基因的不同基因型与产奶性能间存在相关性:FF基因型个体前4胎平均产奶量显著低于NN基因型个体(P<0.05),FF基因型个体第2胎产奶量比NN基因型个体低90kg以上(P<0.01),提示CSN1S2基因座F等位基因可能与低产奶量有关。在CSN3HindⅢ基因座中,DE和EE基因型个体在第1、2、3、4胎产奶量和平均产奶量上差异不显著(P>0.05);在CSN3TaqⅠ基因座中,TT、TC和CC3种基因型个体在第1、2、3、4胎产奶量和平均产奶量上差异不显著(P>0.05);CSN3基因经HaeⅢ酶切没有发现多态性。对βlg基因5′侧翼区的分析发现,AA基因型个体各胎次产奶量均比AB型高,其中在第2、3胎产奶量和平均产奶量3项指标上都达到显著水平(P<0.05),提示βlg基因的A等位基因可能与高产奶性能有关。

CSN3、CSN1S2和β-1g基因多态与西农萨能奶山羊产羔数的相关性研究

首次利用PCR-RFLP技术探讨κ酪蛋白(CSN3)、αs2酪蛋白(CSN1S2)和β-乳球蛋白(β-lg)基因多态与69只西农萨能奶山羊产羔数的相关性。结果表明:CSN3-TaqI位点与产羔数之间存在显著相关(P<0.05或P<0.01),如TC基因型个体第1胎产羔数高于CC型(P<0.01),CC基因型个体第2胎产羔数高于CC型(P<0.05);CSN3-HindIII位点与产羔数之间不存在关联(P>0.05);CSN1S2-Alw26I位点与产羔数间存在显著的相关性(P<0.05或P<0.01),如NF基因型个体第1胎产羔高于NN型(P<0.05),NN基因型个体第4胎产羔数高于NF型(P<0.01);β-lg-smaI位点与产羔数间不存在显著相关(P>0.05)。结果提示CSN3和CSN1S2基因对奶山羊产羔数有显著影响,从而推测酪蛋白基因可能与FecB基因连锁。因此,认为CSN3-TaqI和CSN1S2-Alw26I位点可作为奶山羊高产羔数标记辅助选择(MAS)的有效分子标记。

西农萨能奶山羊INSIG-1编码区的克隆、序列特征分析和组织表达

【目的】克隆西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG-1)编码区,并对其进行序列特征分析和组织表达规律研究。【方法】提取西农萨能奶山羊总RNA,反转录cDNA后进行PCR反应,对克隆得到的INSIG-1序列进行生物信息学分析。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测INSIG-1在皮下脂肪、胸部肌肉、乳腺、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏、瘤胃、小肠10个组织中的表达情况。【结果】获得西农萨能奶山羊INSIG-1基因1 014bp序列(Gen-Bank登录号JQ665439),其中编码区序列长度为831bp,编码276个氨基酸。西农萨能奶山羊INSIG-1编码区与牛(GenBank登录号NM_001077909)的亲缘关系最近,相似性达97%,编码氨基酸序列的相似性达90%,而与小鼠(GenBank登录号NM_025836)的亲缘关系较远。预测INSIG-1蛋白质分子量为29.70ku,理论等电点为8.99;IN-SIG-1蛋白质具有5个跨膜螺旋结构,且有较强的疏水性,不含信号肽。RT-qPCR检测结果表明,在西农萨能奶山羊10个组织中INSIG-1均有表达,其中在肝脏中的相对表达量最高,皮下脂肪、胸部肌肉、肺次之,在心脏中的相对表达量最低。【结论】克隆得到了西农萨能奶山羊的INSIG-1基因,并探明了其组织表达规律。

miR-200家族在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析

笔者拟获得山羊miR-200家族乳腺组织表达谱,研究miR-200家族成员之间表达相关性及miR-200家族成员与山羊乳成分的相关性。通过定量PCR,检测miR-200家族在西农萨能奶山羊泌乳中期和干奶期乳腺组织中的表达量;利用Pearson相关系数分析miR-200家族不同成员表达量之间的相关性,同时分析miR-200家族成员与山羊乳成分之间的相关关系;利用miRanda和TargetScan 6.2软件分析、RNAhybrid和PITA软件预测miR-200家族的靶基因。结果表明,miR-200家族在奶山羊泌乳中期的乳腺组织中的表达量极显著高于干奶期(P<0.01);miR-200a与miR-141之间的表达量显著相关(P<0.05),miR-200b与miR-200c之间的表达量极显著相关(P<0.01);泌乳中期奶山羊乳腺组织中miR-200c的表达量与乳蛋白、非脂固形物(SNF)、冰点(FPD)的含量显著相关(P<0.05);经软件分析及预测发现,miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起关键作用的基因STAT4。miR-200家族可能对山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的调控作用。

6个微卫星基因座与西农萨能奶山羊产羔数相关性的研究

选择与羊高繁殖力嚓密关联的微卫星基因座OarAl7,101、BMl329、OarHH55、BMl43、BMS2508和LSCV043，分析其在西农萨能奶山羊群体中的遗传多态性及与西农萨能奶山羊产羔数的关系。结果表明：6个微卫星基因座在西农萨能奶山羊中的有效等位基因数在6．5713～8．9925，多态信息含量在0．8301～0．8781，属于高度多态基因座。6个微卫星基因座对西农萨能奶山羊产羔数的效应分析表明：OarAEl01基因座的109bp等位基因、OarHH55基因座的165和140bp等位基因、BMS2508基因座的140bp等位基因，BMl43基因座的124bp等位基因、BM]329基因座的219bp／185bp基因型以及LSCV043基因座的140bp／120bp基因型，均对西农萨能奶山羊产羔数具有正效应。以上6个微卫星基因座可作为西农萨能奶山羊产羔性状候选基因的遗传标记。

西农萨能奶山羊LXRα基因的克隆、序列分析及组织表达

采集西农萨能奶山羊乳腺组织,利用RT-PCR和RACE技术分离并克隆LXRα基因的cDNA序列。其全长1 654 bp(GenBank收录号为GU332719),包括5′UTR150 bp,CDS1 344 bp和3′UTR160 bp,该基因编码447个氨基酸。经氨基酸序列分析发现,山羊LXRα与GenBank中牛(Bos taurus)、小鼠(Mus muscu-lus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、猪(Sus scrofa)和人(Homosapiens)的LXRα相似性较高,均在90%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质分子量为50.35 ku,等电点为6.3。具有受体特征结构域:配体结合区域(Lig-and-binding Domain,LBD)、DNA结合区域(DNA-binding Domain,DBD)和锌指蛋白C4型区域(Zinc fingerC4 type,zf-C4)。整个序列具有较强的亲水性且不含信号肽与跨膜结构,该基因定位于细胞核。此外,还通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对LXRα基因进行组织表达分析。在所检测的西农萨能奶山羊11个组织中均有LXRα基因的mRNA存在,其中小肠组织中表达最丰富,乳腺、肝脏、脾脏、皮脂次之,心脏相对最低。

GHR基因exon 9和exon 10多态性与西农萨能奶山羊产奶性能的相关分析

针对GHR基因exon 9和exon 10设计了2对引物,采用PCR-SSCP技术检测该基因这2个位点在西农萨能羊群上的单核苷酸多态性,同时研究其对产奶性能的影响。结果表明:exon 9具有多态,exon 10不存在多态性。Exon 9位点在西农萨能山羊中检测到NN型和NT型,纯化测序发现有1个SNP位点,NN型与NT型相比在该片段第241 bp处有1个G→T的突变;NN和NT基因型之间产奶量的最小二乘均值差异显著(P<0.05):NN基因型在各胎次产奶量和平均产奶量等指标上均好于NT基因型,其中在第3胎的产奶量和第4胎产奶量2项指标上都达到显著水平(P<0.05)。研究结果提示:GHR基因exon 9对奶山羊产奶量有显著影响,因此认为GHR基因exon 9位点可作为奶山羊高产奶量的标记辅助选择的有效分子标记。

不同蛋白水平颗粒料对西农萨能奶山羊羔羊哺乳期生长发育的影响

为了筛选西农萨能奶山羊羔羊哺乳期全价颗粒料配方,本试验采用2×3两因子设计,选用出生日期相近（5d之内）、体重相近（3.66±0.69kg）的健康西农萨能奶山羊初生羔羊53只（公羊26只、母羊27只）,按性别和蛋白质水平随机分为6组（A、B、C为三组母羊;D、E、F为三组公羊）,试验期为120d,并分为1~60日龄和61~120日龄两个阶段,两阶段颗粒料苜蓿草粉含量分别为10%和20%,蛋白质水平分别为18%、21%、24%和15%、18%、21%,哺乳期自由采食干草,试验期间采集奶样和饲料样,记录羔羊采食量和生长发育数据。结果表明,试验期间公羔日增重显著高于母羔（P〈0.05）;1~60日龄,A、D组羊羔具有较大的日增重,饲料报酬高,且D组日增重显著高于E、F组（P〈0.05）;61~120日龄,D组具有最大日增重,随着蛋白水平的升高,公羔日增重呈现出降低的趋势,C组母羔显著大于A、B两组（P〈0.05）,公羔间日增重差异不显著（P〉0.05）;饲喂不同蛋白水平颗粒料对哺乳期羔羊腹泻率和血液生化指标无显著影响。试验表明,1~60日龄,蛋白质水平为18%的颗粒料组羔羊生长发育最快,饲料报酬高;61~120日龄,蛋白质水平为21%的颗粒料组母羔增重快。

CSN1S2和CSN3基因表达量与西农萨能奶山羊产奶性状的关系

【目的】研究酪蛋白中αs2酪蛋白(CSN1S2)基因和K酪蛋白(CSN3)基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量及其与产奶性状的关系。【方法】根据山羊CSN1S2和CSN3的mRNA序列(CSN1S2:AJ289716,CSN3:EF564258)设计实时定量特异性引物,采用实时荧光定量PCR法,对年均产奶量不同的3组西农萨能奶山羊进行mRNA转录水平上的相对定量分析,并测定乳脂和乳蛋白的含量,同时对扩增出的mRNA片段进行克隆测序。【结果】CSN1S2基因在第1组15只西农萨能奶山羊(年均产奶量为(1 100.00±15.00)kg)乳腺组织中的相对表达量是第2组15只奶山羊(年均产奶量为(600.00±12.00)kg)的2.47倍,二者差异极显著(P<0.01);CSN3基因在第1组西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量是第2组的3.10倍,二者差异极显著(P<0.01);测序后进行序列比对发现,目的mRNA片段与山羊CSN1S2和CSN3基因的同源性均为100%;CSN1S2基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量与乳汁中蛋白质含量相关性不显著,与脂肪含量呈显著负相关;CSN3基因的表达量与乳汁中蛋白质含量呈显著正相关,与脂肪含量相关性不显著。【结论】CSN1S2基因和CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺中的表达量对乳蛋白和产奶量有显著影响(P<0.05),可作为西农萨能奶山羊产奶性状选育的候选基因。

日粮中添加脂肪酸钙或菜油对西农萨能奶山羊泌乳性能及乳品质的影响

试验旨在研究日粮中添加脂肪酸钙或菜油对泌乳期西农萨能奶山羊产奶性能、乳成分及血浆生化指标的影响。采用单因素试验设计,将27只年龄、胎次、产奶量、泌乳期相近的健康奶山羊随机分为3组,每组9个重复,试验组I每天添加45 g脂肪酸钙,试验组II每天添加36 g菜油,对照组不添加。预试期10 d,正试期90 d。结果表明:1日粮添加脂肪酸钙或菜油分别使乳产量提高了2.67%和1.60%,但差异不显著(P>0.05)。2饲粮添加脂肪酸钙或菜油组试验羊乳中乳脂、全脂固形物呈下降趋势,试验组I乳脂降低的幅度最慢,对照组次之。其他指标差异均不显著(P>0.05)。3饲粮添加脂肪酸钙或菜油,试验组I血浆中葡萄糖含量下降趋势缓慢,试验组II次之;日粮中添加脂肪酸钙的试验组I血浆中尿素氮含量下降最快,对照组次之。其它各时期及各指标差异均不显著(P>0.05)。结果显示,饲粮中添加脂肪酸钙或菜油可提高乳蛋白的含量,减缓血浆中葡萄糖的下降趋势,降低血浆尿素氮含量,而添加脂肪酸钙更有利于提高奶山羊的泌乳性能。

西农萨能奶山羊乳和荷斯坦牛乳挥发性游离脂肪酸组成比较及分子机理分析

以西农萨能奶山羊和荷斯坦牛为对象,研究山羊乳和牛乳挥发性游离脂肪酸组成的差异,并分析其分子机理。采用固相微萃取/GC-MS分析二者挥发性游离脂肪酸组成,对西农萨能奶山羊脂肪酸合成酶乙酰-CoA/丙二酰-CoA转移酶区域(AT-MT)cDNA克隆,对其AA序列及蛋白二级结构与荷斯坦牛进行比较。结果表明西农萨能奶山羊奶中癸酸(40.89g/100g)是影响其风味的主效成分。西农萨能奶山羊AT/MT AA序列、蛋白二级结构与荷斯坦牛存在明显差异。西农萨能奶山羊脂肪合成与代谢相关酶基因应是羊奶膻味形成的关键因素,传统育种和分子育种方法将是提高山羊乳品质的有效途径。

西农萨能奶山羊多胎基因位点的遗传聚合效应分析

【目的】分析西农萨能奶山羊不同微卫星基因位点的基因型和基因型组合在多胎性状形成中的贡献率,探索优良基因的遗传聚合效应。【方法】利用微卫星标记与群体系谱记录,以优秀多胎个体为研究起点,上溯亲代,跟踪子代,检测典型优秀母羊个体的基因型组合及其与产羔数的关系。【结果】在西农萨能奶山羊群体中找到A3A7、B1B6、C1C5和D5D94对产羔率具有正效应的标记,以及A1A5、B4B9、C2C6和D4D84对产羔率具有负效应的标记。基因型组合A3A7B1B6C1C5D5D9的聚合效应值最高(P<0.05);分析比较几个基因型对产羔数的聚合效应值可知,D5D9较D4D9高5.11%,A3A7较A1A6高15.32%,C1C5较C2C6高8.11%,B1B6较B5B10高8.50%,D7D10较D4D9高10.09%,D5D9较D1D5高15.62%,D4D9较D1D5高11.08%,D2D6较D1D5高39.64%。【结论】在亲代到F1代的基因传递过程中,基因型组合具有明显的聚合效应;在F1代到F2代的基因传递过程中,基因型组合出现了明显的分离现象。

不同能量水平日粮对西农萨能奶山羊产奶量及乳成分的影响

为了筛选西农萨能奶山羊泌乳期全价料最适能量水平,选取体重(50.56±0.76)kg、胎次(2～3)、产奶量(2.12±0.10)kg/d相近及分娩日期与体况一致,并处于泌乳高峰期的健康西农萨能奶山羊36只,采用单因子随机区组试验设计,随机分为A、B、C、D四组,每组9只,分别饲喂能量(指净能水平,下同)水平为12.53MJ/(d.只)、12.80MJ/(d.只)、13.07MJ/(d.只)和13.19MJ/(d.只)。试验期为63d,预试期7d;正试期56d,共分为4个阶段,每阶段2周。结果表明,随着日粮能量水平的提高,各阶段试验羊采食量及产奶量均呈先上升后下降的趋势,饲喂12.8MJ/(d.只)能量日粮山羊可获得最大平均采食量;饲喂能量水平为13.07MJ/(d.只)的日粮山羊可获得最大产奶量;不同能量水平对山羊乳成分及血液生化指标没有显著影响。

西农萨能奶山羊泌乳均衡性与产奶量的相关分析

【目的】研究西农萨能奶山羊泌乳均衡性与产奶量的相关关系,为奶山羊良种选育与改良提供依据。【方法】选择健康、泌乳正常的西农萨能奶山羊120头,测定衡量泌乳均衡性的泌乳初期日数、泌乳盛期日数、泌乳后期日数、最高日产奶量、最低日产奶量、最高日产奶量与最低日产奶量之差6个指标,采用相关系数分析法确定这6个指标与300 d产奶量之间的相关关系,并建立最优回归方程。【结果】通径分析表明,最高日产奶量和最低日产奶量是影响300 d产奶量的最主要因素(通径系数分别为0.269 5和0.235 7),同时也是衡量泌乳均衡性的重要指标;对120只羊300 d产奶量实测值与估测值的差异显著性分析表明,二者差异不显著,说明用这2个性状建立的多元回归方程准确性良好。【结论】利用最高和最低日产奶量这2个性状建立的回归方程估计奶山羊产奶量简便易行,可为奶山羊育种及提高产奶量提供可靠的依据,也是估计产奶量的一种适用方法。

西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因5′侧翼区多态性分析

根据β-乳球蛋白基因的DNA序列设计了1对引物,用PCR-RFLP技术对56只西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因5′侧翼区进行了多态性分析。结果发现,在西农萨能奶山羊群体中,PCR所扩增出的710bp片段经限制性内切酶Sam 消化后,表现出3种基因型。等位基因A,B的频率分别为0.91和0.09,3种基因型AA,AB,BB的频率分别为0.821,0.179和0.000。经检验,在所研究的群体中,该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。

西农萨能奶山羊群体的遗传变异分析

通过对５７只西农萨能奶山羊９个血液蛋白位点的遗传变异分析表明：西农萨能奶山羊在Ｈｂ、Ｔｆ、Ａｃｐ及Ｃａｔ四个血液蛋白位点上具有明显的种群特异性，与原种群瑞士萨能奶山羊的遗传分化系数达１５．５７％，与国内外１１个山羊品种间的遗传关系相对较近。在我国山羊品种中是一个遗传资源极为丰富的代表品种之一，属重点保护及开发利用的对象。