西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建

山羊脂肪酸合酶（Fatty acid synthase,FAS）是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用。设计了shRNA-5544、shRNA-5936s、hRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果。在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10~12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID50法测定重组腺病毒滴度分别为6×108PFU/mL（表达shRNA-5544序列）、5×108PFU/mL（表达shRNA-5936序列）及6×108PFU/mL（表达shRNA-NC序列）,为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础。

西农萨能羊泌乳高峰期和初期乳腺组织差异表达基因研究

利用抑制性削减杂交和实时定量PCR研究西农萨能羊泌乳高峰期差异表达基因，结果表明成功构建泌乳高峰期和泌乳初期乳腺组织差异表达削减eDNA文库，以GAPDH为指标检测文库削减效率为2^5倍，共获得78个阳性克隆，PCR检测插入片段主要分布在150～1000bp，挑选插入片段不等的30个克隆测序，获得25个有效序列，代表18个基因。对文库中所包含的血清淀粉样蛋白A3（SAA3），ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2），心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）和黄嘌呤脱氢酶（XDH）进行实时定量PCR检测，发现上述4个基因在泌乳高峰期乳腺组织中的表达水平分别是泌乳初期的17．0，7．7，16．3和1．7倍。结论：构建的消减文库可用于筛选泌乳高峰期差异基因，已鉴定的4个基因很可能是调控产奶量和乳成分变化的候选基因。

西农萨能羊凝乳酶原前体cDNA的克隆与序列分析

参照GenBank登录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列设计引物,以新生5d的西农萨能羊皱胃组织总RNA为模版,通过RT-PCR方法获得凝乳酶原前体cDNA,克隆测序后进行序列比对。结果表明,克隆基因为B型凝乳酶,该基因cDNA具有1292个碱基,编码381个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽序列和42个氨基酸的酶原序列。将其与已报道的山羊、绵羊和牛的凝乳酶原前体序列进行比对,发现核苷酸同源性分别为99.41%、98.74%和95.29%,氨基酸同源性为99.21%、98.42%和93.70%。

西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析

为了研究不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因,利用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊泌乳60 d乳腺组织及泌乳28 d乳腺组织中差异表达基因文库,用Real-Time PCR技术验证阳性克隆血清淀粉样蛋白A 3(SAA3)基因,通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织SAA3,并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库,筛选克隆了乳腺组织SAA3基因,GenBank登录号为:DQ839400,编码区长度为396 bp,含有131个氨基酸。西农萨能羊乳腺组织中SAA3与牛(GenBank:NM_181016)、兔(GenBank:M64696.1)、人(GenBank:BC020795)、鼠(GenBank:NM_011315)核苷酸同源性分别为95%、84.3%、81.3%和81.9%,氨基酸同源性为93%、76%、72%、72%;在编码区261-287位较人、兔、鼠SAA编码区多27个碱基,连续大于5个氨基酸的保守区域有6个,较人SAA多3个潜在功能基序。

西农萨能羊凝乳酶原基因的克隆与原核表达

【目的】克隆西农萨能羊凝乳酶原基因并进行原核表达,对表达产物凝乳酶原复性后进行活性检测,为西农萨能羊凝乳酶制剂的微生物发酵生产奠定基础。【方法】从西北农林科技大学西农萨能羊原种场新生公羔羊的皱胃组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶基因全长编码区序列。将该基因连接到原核表达载体pET-30a中,构建重组菌pET-30a/Chymosin,经酶切、测序鉴定后进行凝乳酶的小量表达、大量表达、Western杂交鉴定、纯化、复性和活性测定。【结果】通过RT-PCR方法获得了西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,并构建了重组菌pET-30a/Chymosin;通过体外原核表达获得了西农萨能羊凝乳酶原,将酶原进行复性后测得重组菌酶活力为93.2U/mL。【结论】利用西农萨能羊凝乳酶原基因,通过构建原核表达载体和体外表达可以得到凝乳酶原,通过蛋白纯化和复性可得到有活性的凝乳酶。

日粮中不同蛋白质和L-赖氨酸水平对西农萨能羊泌乳性能和血浆生化指标的影响

本试验采用2×2因子完全随机试验研究日粮中蛋白质和L-赖氨酸水平对西农萨能羊泌乳性能和血浆生化指标的影响,以筛选泌乳母羊最佳日粮配方。将48只泌乳量和体重接近、处于泌乳盛期(50 d左右)的健康西农萨能羊随机分成4组,每组12只。日粮蛋白质水平分别为16.0%、18.0%,L-赖氨酸水平分别为0、0.67%。预试期7 d,正试期90 d。结果表明:不同蛋白质和L-赖氨酸水平对产奶量和乳成分无显著影响(P>0.05),18%蛋白组产奶量与16%蛋白组相比有下降趋势;血浆生化指标分析表明,蛋白水平为16%、L-赖氨酸为0.67%试验组(第2组)的血浆总蛋白高于其他试验组,且在60 d时差异显著(P<0.05),此试验组的血浆尿素氮浓度低于其他试验组,但差异不显著(P>0.05)。由此可见,蛋白水平为16%、L-赖氨酸为0.67%的日粮更有利于提高泌乳期奶山羊的生产性能。

不同蛋白水平日粮对西农萨能羊公羔肥育性能的影响

本研究旨在探讨不同蛋白水平日粮对西农萨能羊公羔肥育性能的影响。选择21只健康、体重相近的6月龄西农萨能羊公羔,随机分为3组,分别饲喂蛋白水平为19.5%、16.0%、13.4%的日粮。试验为期50 d,测定试验羊的体重、体尺、血液生化指标、屠宰性能和羊肉品质。结果显示:高蛋白组试验羊体重、日增重、胸围、体斜长最大,料重比最小(P>0.05);血浆中总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇含量高于中、低蛋白组(P>0.05);屠宰率、净肉重、肉骨比、眼肌面积具有最大值(P>0.05);羊肉失水率最低(P>0.05)、嫩度最好(P<0.05)。经综合评定,19.5%蛋白水平日粮更有利于西农萨能羊公羔短期育肥。

不同能量蛋白水平日粮对妊娠后期西农萨能羊生产性能和血液生化指标的影响

本试验旨在研究不同能量蛋白水平日粮对妊娠后期西农萨能羊生产性能和血液生化指标的影响,以筛选出妊娠后期母羊最适的营养水平。试验采用2×2两因子完全随机区组试验设计,将60只处于妊娠期90 d、体重(60±2.4)kg的经产母羊随机分成4组,每组15个重复。日粮干物质蛋白水平分别设为14%、16%;能量水平分别为12.2 MJ/kg.DM和13.3 MJ/kg.DM。结果显示,试验母羊血浆总蛋白和尿素氮含量均与粗蛋白摄入量成正比,血浆白蛋白的含量则与之相反(P>0.05)。低蛋白高能量(14%、13.3 MJ/kg.DM)试验组的母羊具有较高产羔率(227%)、成活率(94.118%),该组母羊所产羔羊具有最大平均初生重(4.10±0.14)kg该试验组初乳具有较高乳总干物质(21.73%)、乳脂(7.71%)和乳蛋白含量(9.30%)(P>0.05),较低的乳糖含量(P<0.05)。试验表明,蛋白、能量水平分别为14%、13.3 MJ/kg.DM的日粮为妊娠后期西农萨能母羊最优的日粮组合。

不同蛋白水平对西农萨能羊泌乳性能的影响

本试验旨在探求西农萨能羊饲料中最合适的蛋白水平,以充分发挥奶山羊的泌乳性能、提高山羊的奶品质。试验采用单因素试验设计,选择处于泌乳盛期体重、胎次、泌乳量接近的健康西农萨能羊,随机分成3组,每组11只。固定能量水平为12.51 MJ/kgDM,蛋白水平分别为10%、14%和18%。试验期共100 d,预试期10 d,正试期90 d。结果表明:随着试验的进行,各组产奶量呈下降趋势,10%蛋白水平组下降幅度最大,14%蛋白组次之,18%蛋白组下降幅度最小;各试验组乳成分分析表明,18%蛋白组中乳脂、乳糖和全脂固形物降低幅度最明显,10%蛋白组降低幅度次之,14%蛋白组降低幅度最小。本试验中同等能量水平,不同蛋白水平对奶山羊产奶量和乳成分影响差异不显著(P>0.05)。

不同蛋白水平颗粒料对西农萨能奶山羊羔羊哺乳期生长发育的影响

为了筛选西农萨能奶山羊羔羊哺乳期全价颗粒料配方,本试验采用2×3两因子设计,选用出生日期相近（5d之内）、体重相近（3.66±0.69kg）的健康西农萨能奶山羊初生羔羊53只（公羊26只、母羊27只）,按性别和蛋白质水平随机分为6组（A、B、C为三组母羊;D、E、F为三组公羊）,试验期为120d,并分为1~60日龄和61~120日龄两个阶段,两阶段颗粒料苜蓿草粉含量分别为10%和20%,蛋白质水平分别为18%、21%、24%和15%、18%、21%,哺乳期自由采食干草,试验期间采集奶样和饲料样,记录羔羊采食量和生长发育数据。结果表明,试验期间公羔日增重显著高于母羔（P〈0.05）;1~60日龄,A、D组羊羔具有较大的日增重,饲料报酬高,且D组日增重显著高于E、F组（P〈0.05）;61~120日龄,D组具有最大日增重,随着蛋白水平的升高,公羔日增重呈现出降低的趋势,C组母羔显著大于A、B两组（P〈0.05）,公羔间日增重差异不显著（P〉0.05）;饲喂不同蛋白水平颗粒料对哺乳期羔羊腹泻率和血液生化指标无显著影响。试验表明,1~60日龄,蛋白质水平为18%的颗粒料组羔羊生长发育最快,饲料报酬高;61~120日龄,蛋白质水平为21%的颗粒料组母羔增重快。

西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织差异基因的筛选

旨在利用抑制性削减杂交（SSH）技术筛选西农萨能奶山羊泌乳中期和后期的差异表达基因,并用实时定量PCR（Q-PCR）分析差异基因的表达丰度,探讨奶山羊不同泌乳阶段乳腺组织的基因表达规律。本研究以西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织的mRNA互为检测子（Tester）和驱动子（Driver）构建cDNA消减文库（M-L和L-M）,随机挑选克隆测序,进行序列比对分析,并检测部分差异基因在乳腺组织中的表达丰度。结果,成功构建了泌乳中期和后期的cDNA文库,随机挑选30个克隆测序,得到M-L和L-M文库中与细胞凋亡、抗氧化、脂类代谢、能量代谢等生理过程相关的差异基因,对其中的6个基因进行实时定量分析,发现5个均为阳性克隆,表达水平增加了1.3~5.5倍不等。结果表明,利用SSH技术成功构建了泌乳中期和后期乳腺组织正反向消减cDNA文库,筛选出24个差异基因,为进一步研究奶山羊乳腺组织基因调控机理奠定了基础。

miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响

旨在构建pAd-pri-miR-200a重组腺病毒,使其在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,研究miR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响。以西农萨能羊DNA为模板扩增pri-miR-200a。采用Ad-Easy系统构建重组腺病毒载体pAd-pri-miR-200a,并于HEK 293细胞株中进行病毒的包装、扩繁。TCI50法测定病毒滴度。qRT-PCR检测miR-200a及16个乳脂合成相关基因mRNA表达水平。序列分析结果显示,pri-miR-200a包括pre-miR-200a86bp和侧翼序列共297bp。酶切结果证实pAd-pri-miR-200a构建成功。Ad-pri-miR-200a滴度达8×109 PFU.mL-1。实时定量结果表明,Ad-pri-miR-200a(MOI为200)感染奶山羊乳腺上皮细胞72h,miR-200a的表达量较对照高出2.4倍。同时miR-200a的过表达引起10个基因mRNA表达量下调,6个基因mRNA表达量上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TIP47及脂肪酸运输相关基因FABP4降幅较大,分别下降了0.47、0.89及0.65倍。而TAG生成相关基因DGAT1和脂解相关基因HSL较对照分别增加了0.52和1.49倍。本研究获得的重组腺病毒Ad-pri-miR-200a能在山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,同时miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。

1～15月龄西农萨能母羊血浆生化指标和生殖激素变化规律研究

本试验旨在研究1～15月龄西农萨能羊血浆生殖激素和生化指标的变化规律。选取30只出生日期相近、体重相似的健康西农萨能羊母羔进行饲喂,每隔30天空腹颈静脉采血1次,以测定母羊自出生至妊娠、分娩中血浆4种生殖激素以及生化指标含量的变化。结果表明:哺乳期羔羊血浆雌激素、孕酮、卵泡刺激素、黄体生成素含量较低,此后逐渐上升;妊娠阶段母羊血浆雌激素、孕酮含量逐渐上升,卵泡刺激素、黄体生成素水平显著下降;分娩后试验羊血浆雌激素、孕酮释放水平逐渐下降,卵泡刺激素、黄体生成素含量略有上升。1～10月龄试验羊血浆总蛋白、白蛋白含量逐渐上升,妊娠阶段显著下降,分娩后有所回升。妊娠阶段试验羊血浆总胆固醇、甘油三酯、尿素氮水平急剧升高,分娩后逐渐下降。妊娠对试验羊血浆生化指标、生殖激素含量存在显著影响(P<0.05)。生殖激素浓度变化规律可为奶山羊早期选种和高效扩繁提供试验依据。