体外转录法制备西尼罗河热病毒RNA片段

目的通过体外转录获得西尼罗河热病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计西尼罗河热病毒基因保守区克隆引物,PCR从合成的基因DNA获得相应片段,连接至质粒PGEM-T-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用RT-PCR验证。结果获得含西尼罗河热病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6ng/μL,RT-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为西尼罗河热病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。

5种外来动物疫病并联荧光定量PCR检测方法的研究

根据GenBank中发表的相关病毒的基因序列,通过分析比较小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、西尼罗河热病毒(WNV)、亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)的保守区域(PPRV的N基因、ASFV的P72基因、HeV和NiV的H基因,以及WNV的PrM基因),各设计筛选出一套特异性引物和Taqman探针,建立了5种外来动物疫病并联荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法,对103份样本进行了临床检测,结果除阳性对照外,其他均为阴性。检测结果验证了本研究建立的Taqman模式并联荧光定量PCR检测方法具有鉴别诊断的特点,可以作为临床检测这5种病原体的参考方法。