美国西尼罗病毒的风险监测及管理

西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)是重要的虫媒病毒之一。美国自1999年首次在纽约市发现WNV以来,在WNV感染风险监测和管理方面进行了大量的研究和实践。建立的以蚊子、鸟类为基础的环境监测系统,不仅起到了对WNV感染早期预警的关键作用,同时还为下一步制定防控措施提供了依据;采取的虫媒综合管理和分阶段风险响应管理等措施,成功控制了WNV的传染源和传播途径,为减轻其对公共卫生的影响起到了关键作用。本文介绍了美国WNV流行情况、风险监测方法及风险管理措施,以期对我国WNV感染等虫媒传播人兽共患病的流行病学研究、早期预警、口岸风险分析以及科学防控提供依据。

西尼罗热流行和传播机制研究进展

西尼罗热是较早(1937年)发现的虫媒传播的人兽共患病之一,近年来在美洲、欧洲和非洲许多地方发生了人和马的疫情暴发流行,对人类和动物健康造成严重威胁。本文对蚊子和鸟在西尼罗病毒流行传播中作用、鸟-蚊-鸟的传播机制研究进行了详细探讨。综述分析发现:蚊子只是西尼罗病毒的载体和媒介,而鸟类才是其真正宿主,并在病毒的跨地区传播中扮演重要角色,鸟-蚊-鸟传播机制是西尼罗病毒维持地方性流行的重要模式;人类以及马、狗和山羊等哺乳动物是西尼罗病毒的终端宿主,人类还可以通过输血和器官移植获得感染。基于西尼罗热的流行病学特征,我国急需对候鸟栖息地持续开展鸟类和蚊虫的西尼罗病毒监测,深入开展西尼罗病毒媒介以及气候和环境等多种因素影响的流行病学机制及风险评估研究,为建立早期预警机制和制定防控措施提供科学依据。

西尼罗病毒RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

目的 建立西尼罗病毒 (WestNilevirus ,WNV)RT PCR检测方法 ,为WNV感染的诊断和流行病学调查奠定基础。方法 选择Vero E6细胞进行WNV培养 ,通过乳鼠脑内接种病毒培养液获得WNV感染脑组织。在病毒基因组E区和C区设计 3对引物 ,以WNV培养液 ,建立并优化病毒核酸RT PCR分析方法。然后 ,以此对感染蚊虫模拟标本和乳鼠脑组织进行检测。PCR产物测序后 ,用Blast进行同源性分析。结果 用RT PCR在WNV培养液中扩增出与预期大小一致的核苷酸片段 ,并通过改变循环数 ,模板稀释倍数等参数对该方法进行了优化 ;将建立的方法用于检测感染蚊虫模拟标本和感染乳鼠脑组织 ,均检测出WNV目的基因片段 ,且扩增效果与病毒培养液无明显差异 ;套式PCR能显著提高检测的敏感性 ( 10 8-10 9倍 )。结论 本研究建立的WNVRT PCR检测方法具有较高的敏感性 。

双重荧光定量PCR检测西尼罗病毒和基孔肯雅病毒

目的建立同时检测西尼罗病毒(WNV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)的双重荧光定量PCR法,为临床疑似病例的诊断提供依据。方法分别针对WNV CAP基因、CHIKV E1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重荧光定量PCR反应体系,评价方法的特异性和灵敏度。结果建立的双重荧光定量PCR可同时检测WNV、CHIKV核酸,标准曲线相关系数(r)分别达0.999、0.998,灵敏度达10 copies/μL,具有良好的特异性。结论建立了同时检测WNV、CHIKV的双重荧光定量PCR法,但尚需临床进一步验证。

实验感染的三带喙库蚊和来亨鸡体内西尼罗病毒的分离与鉴定

采用C636细胞培养分离活病毒、间接免疫荧光染色检测病毒抗原、RTPCR扩增病毒基因片段和PCR产物测序等方法,对实验感染的三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus和来亨鸡血液样本中的西尼罗病毒进行分离和鉴定。结果表明,接种实验感染蚊虫研磨液和来亨鸡血液样本的C636细胞出现细胞融合、空泡形成的病变效应;用西尼罗病毒抗血清进行间接免疫荧光染色,感染病毒的细胞呈现黄绿色荧光,为阳性反应;采用3对不同引物的RTPCR体系扩增分别出现预期的408bp、498bp和559bp的基因片段,序列测定证实扩增序列与实验所用毒株相应的基因序列基本相同。从而证实实验感染三带喙库蚊和来亨鸡体血液内的西尼罗病毒与实验感染所用的西尼罗病毒Chin01株一致。

两种快速检测西尼罗病毒方法的研究

目的建立可用于中国的蚊虫携带西尼罗病毒(WNV)监测的快速检测方法。方法选择两种快速检测方法VecTest试剂盒和Ramp系统,对其检测WNV的敏感性、精确性以及与流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的交叉反应进行研究,同时对采自北京市野外的蚊虫进行WNV检测。结果Ramp试剂盒检测方法比VecTest试剂盒方法敏感性高,但后者检测时间短、操作简便,更适合现场筛查使用;经RT-PCR方法确认此2种快速检测方法无假阳性及假阴性结果;VecTest试剂盒和Ramp系统与乙脑病毒也无交叉反应。使用这2种检测方法对北京市6种野外蚊虫进行了WNV检测,结果均为阴性。结论VecTest试剂盒和Ramp系统均可用于WNV快速检测。

新疆地区蚊类携带西尼罗病毒情况调查研究

为查明新疆地区蚊体内携带西尼罗病毒的情况，从2005年--2007年每年的7月～10月采集新疆不同地区的蚊子共计16000余只，并提取总RNA，通过RT-nestPCR的方法检测样品中西尼罗病毒。结果表明，调查样品中没有检测到西尼罗病毒，但不能就此推测新疆是否存在西尼罗病毒，至少对新疆地区和全国制定针对不同动物和人的积极防御政策有重要的公共卫生学意义。

间接免疫荧光试验在西尼罗病毒抗体检测中的初步应用

目的了解人群血清西尼罗病毒(WNV)抗体存在的本底,探讨WNV与乙型脑炎病毒(JEV)的免疫交叉反应。方法以新兵入伍健康体检时收集的男性血清347份为检测标本,应用建立的间接免疫荧光试验(IFA)对WNV与JEV的IgG抗体进行检测。结果血清WNV和JEV的抗体阳性率分别为3.2%(11/347)和5.7%(14/244);在同时检测了两种病毒抗体的244份标本中,有3份两者均为阳性,分别占WNV和JEV抗体阳性数的60%(3/5)和21%(3/14)。结论人群对WNV缺乏免疫力,JEV抗体对WNV的交叉免疫作用有一定的局限性。

江苏省西尼罗病毒病潜在蚊媒调查

目的了解江苏省西尼罗病毒病潜在蚊媒群落构成及季节消长情况,为及时有效地切断西尼罗病毒病传播途径提供科学依据。方法2004年4～11月在江苏省苏州、镇江和连云港3市的城区和郊区设点调查成蚊和幼蚊;成蚊调查采用人工小时法和帐诱法,幼蚊调查采用勺捞法。结果初步调查全省西尼罗病毒病潜在蚊媒有5属8种,郊区优势种群为淡色库蚊、三带喙库蚊和骚扰阿蚊,城区优势种为淡色库蚊;成蚊6～10月高发,9月份盛发;4～11月全省幼蚊平均密度为4.906只/勺,成蚊平均密度为22.399只/人工小时;苏州、镇江、连云港3市分别为8.013、26.182和34.944只/人工小时;城区和郊区分别为12.632、25.757只/人工小时;郊区室内和野外分别为20.617、28.057只/人工小时。结论基本了解了江苏省西尼罗病毒病潜在蚊媒的群落构成及季节消长情况。

西尼罗病毒研究进展

在最近20年以来西尼罗病毒不断感染人畜,导致相关西尼罗河疾病暴发流行,给人类带来危害并造成畜牧业严重的经济损失。通过对西尼罗病毒的病原学、流行特征、临床表现、诊断以及疫苗的研究进行概括,为进一步了解和研究该病毒提供依据。

西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在昆虫S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的西尼罗病毒(WNV)E domainⅢ基因序列设计1对引物,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段,回收目的基因片段定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,用PCR方法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E do-mainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。

西尼罗病毒病诊断技术研究进展

西尼罗病毒病(WND)是由西尼罗病毒(WNV)感染引起的一种人兽共患的急性传染病,应用各种诊断技术对该病进行准确、及时的诊断是预防和控制该病的前提。论文就近年来WND诊断技术研究进展情况进行综述,包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断。在病原学诊断方面,主要包括病毒分离鉴定、抗原捕获ELISA及基于膜的电化学生物传感器技术等。在血清学诊断方面,主要包括ELISA方法、补体依赖性细胞毒性反应、基于微球的免疫测定方法及表面增强拉曼散射等。在分子生物学诊断方面,主要包括RT-PCR和RT-nPCR、real-time RT-PCR、实时快速反转录环介导恒温扩增及依赖核酸序列的扩增技术等,并对各种方法的前景和优缺点进行了阐述,为实际应用及新方法的建立提供参考。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测西尼罗病毒

目的建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法,用于西尼罗病毒(WNV)疾病的早期诊断。方法采用RT-PCR扩增WNV基因片段,将其克隆至T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;阳性质粒用于替代WNV,以阳性质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。结果经测序证实扩增片段属于WNV,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法可检测到10拷贝的西尼罗病毒RNA,而对其他黄病毒科成员日本脑炎病毒及登革热病毒的检测则为阴性,表明该方法特异。结论SYBR GreenⅠ荧光定量PCR简便快速,具有较高的敏感性和特异性,可以成为一种早期检测西尼罗病毒的新方法。

新疆部分地区动物西尼罗病毒感染的调查

为了解新疆部分地区动物西尼罗病毒(WNV)的流行状况,采用一步法实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)对采自新疆伊犁河谷地区以及巴音布鲁克草原的200份马血样、100份驴血样和100份犬血样外周血单核细胞中的WNV包膜蛋白(E)基因片段进行了检测。结果显示,被检血样中未发现WNV E基因片段,目前尚没有证据表明我国新疆部分地区的动物中存在WNV感染。提示,近期内该地区出现WNV流行的可能性小。

媒介蚊虫在西尼罗病毒传播循环中的作用

西尼罗病毒的频繁爆发和迅速蔓延成为当今全球普遍关注的新的公共卫生问题。研究证实蚊虫为其主要的传播媒介。为了探讨蚊虫在西尼罗病毒传播中的地位和作用,本文就西尼罗病毒相关的媒介蚊虫的种类、影响蚊虫感染和传播的因素以及蚊虫对于长期保存病毒的机制进行了综述,提出西尼罗病毒传播循环中蚊媒生物学的研究方向。

西尼罗病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立荧光RT-PCR方法,用于检测西尼罗病毒(WNV)。方法从GenBank上调取WNV的基因序列,设计WNYA、WNYB、WNYC三套荧光RT-PCR,经优化后用于WNV灭活苗、乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)等11种病毒核酸的检测,同时用10倍倍比稀释的双链DNA、质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增,以检测其灵敏度。结果建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR检出WNV灭活苗阳性,而JEV等10种非WNV病毒均为阴性,能检出30个拷贝和65个拷贝的双链DNA、420个拷贝和460个拷贝的质粒DNA;WNYB的反转录效率明显低于WNYA和WNYC。结论建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR可作为检测WNV的技术储备。

TaqMan MGB Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒方法的建立

目的建立一种灵敏、特异、高效的西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)感染诊断和流行病学调查的实验室检测方法。方法用C6/36细胞培养WNV并用Vero细胞蚀斑法滴定病毒浓度;根据WNVC蛋白基因组保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针,用细胞培养病毒液进行方法的条件优化;用不同病毒评价方法的特异性,用系列浓度病毒稀释液和染毒蚊子评价方法的灵敏性。结果建立的TaqMan MGB Real-time RT-PCR方法可检出低于0.01PFU的WNVRNA,并可检出只含3只染毒蚊的标本;用该方法检测4种血清型登革病毒标准毒株、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒均为阴性。结论新建TaqMan MGB Real-time RT-PCR方法具有极高的特异性和灵敏性,是实验室早期诊断WNV感染和调查媒介携带WNV情况的理想方法。

西尼罗病毒诊断的研究进展

西尼罗病毒（WestNileVirus，WNV）首次于1937年12月在乌干达西尼罗地区的一名发热成年女性血液标本分离到，属黄病毒科（Flavivirdae）黄病毒属（Flavivirus）的乙型脑炎病毒血清群。可导致人类西尼罗热（westNileFever）或西尼罗脑炎（WestNileEncephalitis）。发病者常常出现发烧、头痛、皮疹、淋巴结肿大等症状，严重时表现为无菌性脑膜炎，甚至死亡。

实验感染蚊虫及来亨鸡体内西尼罗病毒的RT-PCR检测

根据已发表的西尼罗病毒Chin-01株基因序列,参照文献资料选择合成一对引物,建立西尼罗病毒的RT-PCR检测方法,对反应条件进行了系列优化后,应用于感染蚊虫样本及来亨鸡血液样本中的病毒核酸检测。该方法的检测敏感性达到1·0PFU,感染蚊虫样本和来亨鸡血液样本均能够扩增出与预期值大小一致的特异性区带,经序列测定证明,与实验感染所用病毒株序列完全相同。可见RT-PCR是检测实验感染蚊虫和来亨鸡体内西尼罗病毒行之有效的方法。