西瓜嗜酸菌趋化性的初步研究

瓜类细菌性果斑病是世界范围的检疫性细菌病害,病原菌为西瓜嗜酸菌,带菌种子为主要侵染源。病原细菌在寄主表面的定殖能力与其致病能力关系密切,而趋化性是决定定殖能力的关键因素之一,研究不同物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响对防治瓜类细菌性果斑病具有重要意义。本文采用毛细管法,研究了碳源、氨基酸、有机酸及其他物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响。结果表明,所测碳源中,麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖均显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;所测氨基酸中,L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺和L-丙氨酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;所测有机酸中,琥珀酸、半乳糖醛酸和酒石酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;氯化钠、硫酸镁等对西瓜嗜酸菌的趋化性无显著影响。

西瓜嗜酸菌tatB基因生物信息学分析

为了解西瓜嗜酸菌（Acidoworax citrulli）双精氨酸转运系统（Twin—arginine translocation system，Tat）关键基因tatB的生物信息学信息，利用相关软件对西瓜嗜酸菌和其他7种革兰氏阴性菌的TatB蛋白进行理化性质分析，氨基酸序列分析以及遗传距离分析；同时对西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性、跨膜结构域以及三级结构模型进行了预测。结果表明，西瓜嗜酸菌TatB的理化性质和洋葱布克氏菌（Burkholderia cenocepacia）更加接近，水稻自叶枯病菌TatB理化性质与其他6种细菌的相差较远：西瓜嗜酸菌TatB蛋白遗传关系与水稻自叶枯病菌（Xanthomonasoryzae）的最远，与洋葱酸皮病菌以及茄科雷尔氏菌（Ralstoni0solanacearum）的较为接近；预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白有3个区域的疏水性比较高．在氨基酸序列的2．18位以及100～106位有2个跨膜区域，其三级结构可能为“L”型。对西瓜嗜酸菌tatB基因进行基本生物信息学分析，丰富了其生物信息学资料，有助于对西瓜嗜酸菌的致病机制进行深入研究，为以后选育抗病品种以及研发特异性的新药提供依据。

西瓜嗜酸菌pilL菌毛基因的序列分析

在西瓜嗜酸菌标准菌株AAC00-1全基因组序列中选取了1个菌毛基因pilL序列,利用这个基因设计引物,选取国内外比较有代表性的7株西瓜嗜酸菌菌株进行PCR扩增,并对PCR产物进行了测序,从生物信息学的角度对这7个菌株pilL基因的序列特征、同源性、分子聚类、信号肽、疏水性、跨膜结构和二级蛋白结构进行了预测分析。结果表明:Aac5、pslbtw37、W1和pslbtw22 pilL基因之间的核苷酸氨基酸特征相近,同源性高,AAC00-1、AAC203-50和Fc376之间亦如此。预测发现7个编码蛋白表现为亲水性,都无跨膜结构,Aac5、pslbtw37和W1 pilL基因都存在一个类型为SPI的信号肽,其分泌蛋白所到达的亚细胞位点为s(即分泌到周质空间)。

西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR(4229)的功能研究

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR4229对fliR、fliC、hrpE和hrcN基因均为正调控。基因luxR_(4229)在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。

西瓜嗜酸菌分泌系统的研究进展

植物病原细菌多为革兰氏阴性菌。细菌的分泌系统与其致病性有密切的联系,其研究对揭示植物病原细菌的致病机理具有重要意义。现从细菌分泌系统、西瓜嗜酸菌致病机理及Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统与西瓜嗜酸菌致病性之间的关系等角度出发,重点阐述了与西瓜嗜酸菌分泌系统有关的功能基因,为进一步研究西瓜嗜酸菌的作用机理及寻找其致病性靶标提供理论依据。

LuxR家族调控因子LuxR-2460对西瓜嗜酸菌致病力及生物膜形成的调控（英文）

LuxR家族的调控因子在革兰氏阴性细菌中起重要作用。对西瓜嗜酸菌一个LuxR家族的调控因子LuxR-2460的调控作用进行研究。生物信息学分析表明该调控因子有2个保守结构域:N-末端为REC结构域,C-末端为HTH结构域。通过同源重组双交换的方法,构建了luxR-2460全基因缺失的突变株,该基因缺失突变株能够引起菌株致病力、运动能力及蹭行运动能力的下降及生物膜形成能力的增强。qRT-PCR检测结果表明,该基因缺失导致鞭毛基因fliR在突变株中的表达量下调,影响病菌鞭毛的形成。说明luxR-2460基因对西瓜嗜酸菌的致病能力及相关因子具有重要调控作用,可以作为该病害防控的潜在靶标。

Bio-PCR方法检测葫芦科作物种子携带西瓜嗜酸菌的特异性引物筛选

由西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)引起的细菌性果斑病是一种毁灭性的种传病害,可为害多种葫芦科作物并造成重大经济损失。该病原菌为检疫性有害生物,种子带菌是田间病害发生的最重要初侵染来源,因此,种子健康检测成为病害综合防控过程中的重要环节。Bio-PCR是当前种子携带细菌检测的常用方法,而特异性引物的选择和使用是检测的关键。本研究使用已报道的7对引物对17株西瓜嗜酸菌、10株嗜酸菌属其它种的菌株和6株其它属的植物病原细菌进行了BioPCR检测,筛选出对西瓜嗜酸菌特异性最好的引物为SEQID4m/SEQID5。研究表明:使用该引物对西瓜嗜酸菌M H21纯菌菌悬液的检测限度为10~2CFU·m L^(-1);在人工添加菌悬液的模拟带菌西瓜种子中,使用ASCM和EBBA两种半选择性培养基结合引物SEQID4~m/SEQID5进行Bio-PCR检测,ASCM对种子中带菌量的检测限度可达到0.01 CFU·g^(-1),EBBA对种子中带菌量的检测限度为0.1 CFU·g^(-1)。

不适温度条件诱导西瓜嗜酸菌进入VBNC状态的研究

由西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)引起的瓜类果斑病,是危害西瓜和甜瓜等葫芦科作物的一种典型的种传细菌性病害。已有文章报道西瓜嗜酸菌在铜离子诱导下可进入"有活力但不可培养"(viable but non-culturable,VBNC)状态,并在适当条件下复苏,成为生产中潜在的病害初侵染来源。本文结合实际生产中的种子温汤浸种和低温储藏等条件,分别设定了50℃、55℃高温和4℃低温对西瓜嗜酸菌AAC00-1进行处理,通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)和平板培养法分别检测菌体活性和可培养性。结果显示,不适宜的温度条件能够诱导西瓜嗜酸菌AAC00-1进入VBNC状态,其中55℃高温20和30 min的两个处理,所有活菌均进入VBNC状态。将处理后的AAC00-1接种西瓜子叶,接种植株未表现出果斑病症状,且不能从接种部位分离得到可培养菌体。表明本诱导条件下的VBNC状态A.citrulli菌体不能通过短时间活体接种复苏。本研究分析了西瓜嗜酸菌在不适宜温度条件下进入VBNC状态的能力,为解析病害可能的初侵染来源提供了理论依据,对葫芦科作物果斑病防控具有重要的生产实践意义。

海南省东方市甜瓜细菌性果斑病病原鉴定

细菌性果斑病严重影响甜瓜生产,为确定其病原菌种类,从海南省东方市种植基地采集大量疑似细菌性果斑病的甜瓜样本,进行病原菌分离纯化,并按柯赫法则对获得的菌株进行致病性测定。通过菌落形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列比对分析,对分离病原菌进行鉴定。结果表明,大田采集的所有甜瓜病果中均分离到培养性状一致的细菌,细菌分离率为100%;所有分离菌株均对甜瓜果实具有致病性,该病原菌革兰氏反应呈阴性,其菌落形态及生理生化测定结果与已报道的西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)一致;BLAST比对与A. citrulli菌株的同源性可达100%,系统发育分析也进一步证实该病菌为A. citrulli。研究结果确定了甜瓜果斑病的致病菌,为该病的有效防治提供了依据。

西瓜果斑病菌T2SS分泌蛋白的筛选和功能预测

利用KEGG和STRING数据库分析比较瓜类果斑病菌(西瓜嗜酸菌)(Acidovorax citrulli,Ac)和主要植物病原细菌Ⅱ型分泌系统(T2SS)的基因组成,收集有试验证据的植物病原细菌T2SS分泌蛋白序列信息,与已测序并经注释的果斑病菌AAC00-1菌株基因组进行序列比对,筛选出候选的果斑病菌同源T2SS分泌蛋白。通过对筛选出的分泌蛋白的信号肽、代谢通路、蛋白互作网络及其在植物细胞中的定位进行分析,预测部分分泌蛋白的生物学功能。

不同发酵条件对瓜类细菌性果斑病菌感染西瓜种子的影响

西(甜)瓜果斑病是西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli侵染瓜类作物引起的典型细菌病害,种子带菌是该病最重要的传播方式,防止种子感染是病害预防的首要环节。本研究分析了西瓜种子不同发酵条件对种子感染病菌的影响。研究通过人工接种西瓜发酵液,设置发酵温度为20℃和30℃,检测在不同发酵时间下发酵液pH、A.citrulli菌量、种子外部带菌量、种子内部带菌率,以及出苗发病率,系统地分析比较发酵条件对西瓜嗜酸菌侵染种子的影响。结果表明:从开始发酵到发酵24h,发酵液中A.citrulli菌量快速增长并达到峰值1011cfu/mL,随后逐渐减少;发酵24h的种子外部带菌量最高,达到4×109 cfu/mL;发酵过程中A.citrulli可侵染种皮内部(10%)及种仁(1%);发酵温度对种子感染A.citrulli及幼苗发病率的影响不显著;此外,发酵液菌量与pH相关性显著。以上研究结果表明:控制发酵温度并不能够减少A.citrulli菌的种子感染,减少发酵时间才是减少病菌增殖感染种子的防控关键。

西瓜细菌性果斑病菌在不同场所存活期的检测

选择西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的抗利福平菌株RifAac,通过人工模拟接种试验,采用选择性平板分离、菌落PCR(Bio-PCR)和常规PCR方法,观察该病原细菌在西瓜种子、土壤、病残体和田水中的存活期。结果表明,果斑病细菌在种子表面可存活4～5个月,在田水中可存活2个月,在不含植物残体的土壤中可存活8个月,在含西瓜残体的土壤中可以存活12个月以上。

进境西瓜种子中西瓜细菌性果斑病菌的检测鉴定

由嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)引起的西瓜细菌性果斑病是西瓜等葫芦科作物上的一种极具毁灭性的病害,该病原细菌可以由种子携带传播。本研究通过直接研磨种子,用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和免疫捕捉聚合酶链式反应法(IC-PCR)对进境的西瓜种子进行检测,并且对PCR产物进一步克隆测序。结果表明,在DAS-ELISA产生阳性结果的样品中,IC-PCR结果也产生阳性。序列分析表明,该序列与已知的该病菌16S rRNA基因的相应序列具有100%同源性。因此,2006年这批来自台湾的西瓜种子携带有嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)。

黑龙江省西瓜细菌性果斑病发生初报

对黑龙江省哈尔滨市和双城市西瓜生产中新发现的病害进行了分离培养、纯化以及致病性测定,得到了2个具有致病性的菌株。通过形态学特征、革兰氏染色、生理生化特性以及16SrDNA序列分析进行了病原鉴定。结果表明,这2个菌株均为燕麦嗜酸菌西瓜亚种Acidovor axavenae subsp.citrulli,可引起西瓜细菌性果斑病的发生,这是该病在黑龙江省的首次报道。

药剂处理对三倍体西瓜种子发芽势的影响及对果斑病的防治效果

选用本实验室组配的1号杀菌剂和3种常用药剂,比较了不同药剂及不同浓度的1号杀菌剂处理人工接菌的西瓜种子后对种子发芽、幼苗生长的促进作用和对果斑病的防治效果。结果显示:与对照CK1(种子破壳,清水处理)相比较,72%农用硫酸链霉素可溶粉剂7.2×102μg/mL处理2h、40%甲醛1.6×103μg/mL处理1h和1号杀菌剂0.5×104μg/mL处理2h,发芽势分别高出10.5%、6.7%和4.9%。供试药剂中1号杀菌剂处理种子对果斑病有较好的防治效果,1号杀菌剂0.5×104μg/mL处理2h、1%盐酸3.7×103μg/mL处理30min、40%甲醛溶液处理1h和72%农用硫酸链霉素可溶粉剂7.2×102μg/mL处理2h防治效果分别为74.7%、73.7%、58.5%和49.3%。

应用微滴数字PCR同时检测瓜类种子携带果斑病菌和角斑病菌

细菌性果斑病和角斑病是葫芦科作物两大重要细菌病害,病原菌分别为西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli和丁香假单胞菌黄瓜致病变种Pseudomonas syringae pv.lachrymans。两种菌均可通过种子、种苗带菌进行远距离传播。种子检测是预防和控制这两种病害发生的首要环节。本研究应用微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)建立了同时检测种子携带西瓜嗜酸菌和丁香假单胞菌的方法。结果显示:两种细菌菌悬液和DNA样品等浓度混合时,ddPCR能同时检测到两种靶标菌的最低混合菌悬液浓度和最低DNA浓度分别为10^(3) cfu/mL和10^(-3) ng/μL,其检测灵敏度是平行测试的real-time PCR方法的10倍;对于非等浓度混合的菌悬液和DNA样品,两种靶标菌菌悬液按浓度比1∶1000(10^(3)∶10^(6) cfu/mL)混合或其DNA浓度比为1∶10000(2.28×10^(-3) ng/μL∶22.8 ng/μL)条件下,ddPCR可检测到低浓度的靶标菌,检测灵敏度同样是real-time PCR的10倍。此外,在人工接菌种子测试中,西瓜、甜瓜单粒种子平均带菌量10^(5)~10^(6) cfu/粒时,ddPCR方法可检测到带菌率0.2%(n=500)的西瓜、甜瓜种子样品。将分别携带两种菌的种子按比例1∶10混合时ddPCR方法可以准确检出浓度相对低的靶标菌;而使用相同检测引物的real-time PCR检测方法则只能检出西瓜嗜酸菌和丁香假单胞菌带菌率分别为0.2%和2%(n=500)的甜瓜种子混合样品中的西瓜嗜酸菌,未能稳定检出丁香假单胞菌。综上所述,本研究基于ddPCR技术建立了可同时检测两种重要葫芦科种传细菌的方法,检测结果稳定可靠,丰富了当前种传病原细菌的检测技术体系。

广西甜瓜细菌性果斑病病原鉴定及16S rDNA序列分析

【目的】对广西区内疑似甜瓜细菌性果斑病的病原菌进行分离鉴定,明确引起该病害的病原菌,为甜瓜细菌性果斑病的抗病育种及综合防治提供理论依据。【方法】分别采集南宁市和贺州市疑似甜瓜细菌性果斑病的病叶(编号:WM0922)和病果(编号:XD0611)样品,对样品进行分离纯化,并通过测定分离菌株的致病性、观察菌落形态和培养性状、测定其生理生化性状及比对分析16S rDNA序列,对供试病原菌进行鉴定。【结果】从编号WM0922的病叶上分离得到5株菌株,经致病性测定有3株菌株(WM0922-2、WM0922-3和WM0922-4)具有致病性;从编号XD0611的病果上分离得到8株菌株,经致病性测定有4株菌株(XD0611-5、XD0611-6、XD0611-7和XD0611-8)具有致病性;择优选取具有代表性的菌株WM0922-3和XD061 1-7进行后续试验,发现二者均可侵染葫芦子叶,革兰氏反应均为阴性,培养性状及生理生化测定结果一致,对比分析16S rDNA基因序列,与Acidororax citrulli的相似性均在99%以上。【结论】引起甜瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(A.avenae subsp.citrulli)。

海南甜瓜细菌性果斑病病原菌鉴定

通过田间采集病样,分离到致病性细菌菌株LD101206,采用柯赫氏法则对分离物进行致病性测定,通过对其形态学、培养性状、生理生化性状和16S rRNA基因序列分析,将菌株LD101206鉴定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems)。

甜瓜细菌性果斑病病原菌的分离鉴定及16S rDNA序列分析

从新疆昌吉甜瓜实验田中采集发病甜瓜样品12份,对甜瓜细菌性果斑病病原菌进行分离纯化,并根据形态观察、致病性测定得到甜瓜细菌性果斑病病原菌1株。以该菌总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物进行聚合酶链式反应扩增,并克隆到pGM-T载体,测序结果表明:克隆的16S rDNA序列长度为1 493 bp,通过GenBank上序列比对搜索工具分析,并构建系统发育树,对该菌株进行鉴定,结果表明该菌属于Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems(Aac),即燕麦嗜酸菌西瓜亚种。

Acidovorax avenae subsp.Citrulli危害新寄主籽瓜和病菌的快速检测(英文)

根据病原菌的生物学特性、生理生化特性包括革兰氏染色反应、氧化酶反应、过氧化氢酶反应、氧需求等和特异性PCR扩增结果,以及病原菌危害造成的田间症状,发现燕麦嗜酸菌属西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.Citrulli)可在新寄主-籽瓜上造成严重危害。该病菌在田间主要侵染籽瓜的果实和子叶,症状在果实上尤为明显,形成黑色的星状开裂。为了控制该病的发生,对种子携带病原菌的快速检测方法进行了研究。结果表明,特异性PCR作为检测种传病原菌具有快速、准确和灵敏的特点。当种子浸出液为PCR反应的模板时,可检测出的种子带菌率极限最低为4%;当以种子浸出液提取的DNA为模板时,种子带菌率检测极限为2%甚至更低。