西索米星生产菌株的诱变选育及工艺优化

利用原生质体常压室温等离子体(ARTP)诱变方法选育西索米星高产菌株,经诱变筛选获得一株高产菌株I4-10,其西索米星的生物效价达到1389 U/mL,较原始菌株提高了35.4%。通过对高产菌株I4-10进行碳源、氮源优化,确定可溶性淀粉和牛肉粉是突变菌株I4-10的最适碳源和氮源。进一步采用响应面实验设计方法优化发酵培养基,结果表明黄豆饼粉和DL-蛋氨酸的添加量为显著影响因素,经优化其最适添加质量浓度分别为32.78 g/L和1.75 g/L。在此最适工艺下,西索米星的生物效价提高至1849 U/mL,较原始菌株提高了80%。最后对原始菌及高产突变株中西索米星代谢途径及菌株生长相关的关键酶进行转录水平比较分析,初步解析了突变菌株I4-10高产西索米星的机制。

DK-13和DK-3两种大孔弱酸阳离子树脂提取西索米星的吸附热力学和动力学研究

目的采用静态吸附实验考察了DK-13、DK-3两种大孔弱酸阳离子树脂对西索米星的吸附热力学和动力学行为。方法用刚果红分光光度法测定不同温度和不同初始浓度下的吸附等温线和吸附动力学、热力学曲线等。结果两种树脂对西索米星的吸附过程符合Langmuir吸附等温方程(R2>0.998)和拟二级动力学模型(R2>0.995);热力学参数计算结果显示,吉布斯自由能变ΔG、焓变ΔH、熵变ΔS均大于零,说明其吸附过程为非自发吸热的熵增过程。同时,研究还发现DK-13树脂交换带长度为DK-3的5.2倍,表明DK-13树脂适用于固定床而DK-3树脂用于连续离子交换床更有利。结论本研究结果为大孔弱酸阳离子树脂吸附提取西索米星工艺的工业化应用提供了理论指导。

大孔弱酸树脂提取西索米星的研究

比较几种大孔弱酸树脂和强酸 732树脂提取西索米星的交换和洗脱性能。实验表明 ,弱酸 号树脂对西索米星成品液的静态交换总量可达 18.1万 μg/ ml树脂 ,比 732树脂提高了 80 %; 号树脂 (羧基型 )吸附西索米星的最佳 p H值为 7.5左右 ,其动态交换容量比静态交换容量高 13.8%; 号树脂 (羧基型 )动态吸附、动态解吸提取西索米星的收率达 82 .6 %,比 732树脂提取收率提高 8%;用 5 %氨水动态解吸 , 号树脂 (羧基型 )比 732树脂 (磺酸基型 )易洗脱 ,且洗脱峰集中 ,不拖尾。

产生西索米星的棘孢小单孢阻断型突变株JIM-121的筛选和研究

利用紫外光、氯化锂和甲胺复合因子处理棘孢小单孢JIM-202变株,得到一株JIM-121;其发酵液用离子交换树脂提取、然后用CM-Sephadex C-25分离表明主要含有二个抗生素即121-A和121-B。经薄层层析、红外光谱和核磁共振谱、质谱测定证实抗生素121-A与西索米星同质。根据庆大霉素-西索米星生物合成途径可推断该突变株系在西索米星到庆大霉素C_(1a)这一步转化绛红糖胺部份4′、5′还原反应较弱所致。

西索米星分批发酵的动力学特性

伊尼奥小单孢菌F003的发酵特性研究表明,西索米星发酵过程具有典型的非生长耦联特征.当以淀粉为主要碳源时,对数生长期最大菌体比生长速率为0.058 h-1,产物合成期最大产物比合成速率0.0018 g/(g·h).HPLC和酶法测定结果显示发酵液中主要的可发酵糖为麦芽糖,适合菌体生长的麦芽糖浓度或葡萄糖浓度分别为10.0～25.0和7.5～15.0 g/L,可发酵糖浓度低于10.2 g/L将限制西索米星合成.西索米星发酵过程淀粉水解酶表观活性的动力学特性表明,在对数生长期淀粉水解酶表观活性较高,最大值为0.84 g/(L·h),在发酵中后期淀粉水解酶表观活性仅为最大值的1/4～1/20,导致可发酵糖浓度降低,限制西索米星的合成.西索米星浓度大于0.50 g/L将明显抑制产物合成.

促甲基化因子对西索米星发酵的影响

研究发现，发酵培养基中添加2．0—3．0g,／L蛋氨酸或7．5—10．0mg,／L氯化钴可明显促进西索米星的合成。蛋氨酸的添加时机和添加方式对西索米星产物合成的作用明显不同。在产物合成中前期（30-48h）添加蛋氨酸的效果最佳。当发酵液中蛋氨酸初始浓度为0．656g／L时，与在产物合成初期一次性添加相比，1．5g／L蛋氨酸在产物合成初期、中期和后期均分成3次添加的效果更优，当发酵至91h结束时，发酵液中西索米星浓度可达0．70g／L。

西索米星发酵液的薄层层析生物显影测定

通过对检定菌的敏感性，检定培养基、展开剂和发酵液样品等影响因素的考察，建立了一种检测发酵液中西索米星浓度的方法。采用短小芽孢杆菌为生物显影检定菌，双层琼脂扩散法于37℃培养16～18h，控制检定培养基的PH为7．5～8．0，发酵液样品pH为4．5～7，0，展开剂为15％的KH2PO4，点样量为10μl，薄板和菌层接触时间为20min等检定条件，能用于发酵液中西索米星效价的直接测定，其线性回归方程为 Y＝0．0115X＋1．747，r=0．9877。在相同条件下，对536μg/ml的西索米星标准液连续测定6次，测定结果为（531．0 ±12．7）μg/ml，RSD=3．28％，该法具有较高的实验重复性和准确性，分析稳定性基本符合要求。

HPLC-ELSD和HPLC-MS^n分析硫酸西索米星及其注射液

目的建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法测定硫酸西索米星及注射液的含量和有关物质,并采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(HPLC-MSn)联用,鉴定硫酸西索米星及其有关物质。方法采用Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.05 mol.L-1三氟乙酸溶液-甲醇(90∶10),流速为1.0 mL.m in-1,漂移管温度为50℃,雾化气体压力为3.5×105Pa,在正离子检测方式下,用电喷雾离子阱质谱法对西索米星和有关物质进行多级质谱分析。结果西索米星和有关物质分离良好。西索米星在14~1 100 mg.L-1内呈较好的线性关系(r=0.999 5),重复性实验RSD=1.0%,回收率为99.8%,检测限为5.5 mg.L-1,结合多级质谱裂解初步推断西索米星中主要一个未知有关物质是西索米星分子中发生B环与C环之间的糖苷键断裂,生成的脱去C环(氨基葡萄糖)的降解产物。结论本方法快速、简便,结果准确可靠,重现性好。

西索米星的高效液相色谱测定

以邻苯二甲醛和巯基乙酸为衍生化试剂 ,对西索米星柱前衍生。色谱柱YWG C18( 10 μm ,15 0mm× 4mm) ,甲醇∶水∶乙酸 (内含庚烷磺酸钠 12mmol/L ,pH =6 .3,V/V/V =70∶2 5∶5 )为流动相 ,流速 1.0ml/min ,柱温 2 5℃ ,检测波长 2 5 0 μm ,反相高效液相色谱法分离测定西索米星的含量 ;在一定浓度范围内 ,西索米星的峰面积与浓度呈良好的线性关系 ,相关系数为 0 .9996 ,平均回收率为 99.85 % (n =3)。

西索米星产生菌小单孢菌的诱变育种研究

用常规诱变育种方法对西索米星小单孢菌进行诱变育种，获得ＮＳ８－３０菌株，结合发酵条件研究，发酵效价比原始菌株提高１７倍以上，并在中试生产中应用。获得１株阻断型突变株７－２５，其代谢产物经光谱学分析鉴定为ＪＩ－２０Ａ，并对其代谢途径进行了讨论。

衍生化-高效液相色谱法测定西索米星

采用反相高效液相色谱法 ,以 2 ,4 二硝基氟苯为衍生化试剂。其线性范围为 1 0mg/L～ 5 0 0mg/L ;检出限为 5 0mg/L ;相对标准偏差为 2 .3%。

西索米星原料药中极性小组分的研究

用大孔吸附型树脂对西索米星原料药进行分离，极性小组分首先被洗脱。用高效液相色谱法测定了分离前后的西索米星纯度，发现可从８４％提高到９２％。此外还建立了用硅胶薄层层析检测小组分的方法，并用阳离子交换树脂对小组分进行了分离。采用上述方法可分离得６种小组分。再用Ａｍ－ｂｅｒｌｉｔｅＣＧ－５０、ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５等精制，得各小组分的精制品，经冷冻干燥后进行结构测定。其中含量最多的ＮＡＴ－１、ＵＫ－１与庆大霉素Ａ和加洛糖胺同质，ＮＡＴ－４与庆大霉素Ａ１的文献报道相符；而ＮＡＴ－２、ＵＫ－２经ＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ测定。

磷酸盐对西索米星发酵过程的影响作用研究

考察了无机磷酸盐对西索米星产生菌伊尼奥小单孢菌诱变菌株F0 0 3的菌体生长和产物合成的影响作用。研究结果表明 ,发酵培养基中较高的磷酸盐浓度 (3 .2～ 5 .3mmol/L)虽有助于菌体的生长 ,却抑制西索米星产物的合成 ,这与发酵过程中菌体胞内碱性磷酸酯酶和胞外淀粉酶活力受磷酸盐的调节作用有关。

提高西索米星生产菌产量的遗传育种

在西索米星产生菌橄榄星孢小单孢菌无锡亚种Ｍ－４１的选育过程中，以常规诱变育种为主，结合一些综合处理方法，如原生质体再生、在８－甲氧基补骨酯存在下用近紫外光照射、氯化锂和紫外线的复合处理，筛选自身产物抗性解除反馈调节突变株，同时结合单菌落自然分离纯化法经几十代选育，得到了稳定高产菌株９６－３７，比原始野生型菌株产量提高近３０倍，主组分含量提高到８５％以上。经２０吨规模发酵罐试验，证实菌株９６－３７是一株高产、稳产的工业生产菌种。

静息细胞法研究影响西索米星生物合成因素

利用静息细胞法研究了影响西索米星 (SISO)生物合成的因素 ,设计并建立了静息细胞培养系统 ,筛选了培养基配方及其最适 p H,确定种龄为 30 h,培养时间为 2 0 h。研究发现 ,甲硫氨酸、磷酸盐能明显促进 SISO的合成 ,适宜的浓度分别为 0 .1%和 0 .0 3% ,SISO的合成从培养后 30 h开始。

HPLC法测定硫酸西索米星注射液辅料和抑菌剂含量

目的建立HPLC法测定硫酸西索米星注射液中辅料和抑菌剂方法。方法采用Thermo Syncronis a Q(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水(磷酸调pH值为2.2)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0m L/min;柱温30℃,检测波长200nm,进样量10μL,测定硫酸西索米星注射液中L-半胱氨酸、亚硫酸氢钠、依地酸二钠、焦亚硫酸钠、苯酚、羟苯甲酯、羟苯丙酯和苯甲醇含量。结果各成分之间能有效分离,L-半胱氨酸在0.09882~1.976mg/m L、亚硫酸氢钠在0.4948~9.896mg/m L、依地酸二钠在0.03980~0.6766mg/m L、苯甲醇在0.7603~15.21mg/m L、苯酚在0.09722~1.944mg/m L、羟苯甲酯在0.05045~1.009mg/m L、羟苯丙酯在0.01562~0.3124mg/m L和焦亚硫酸钠在0.9061~6.041mg/m L范围内呈良好的线性关系,回收率分别为89.51%、91.18%、109.62%、103.38%、101.17%、99.64%、100.28%和132.96%,RSD(n=6)分别为4.1%、1.7%、13.0%、0.3%、0.3%、1.8%、1.0%和2.8%。结论建立了较为准确高效的测定硫酸西索米星注射液中辅料和抑菌剂的HPLC方法,为硫酸西索米星注射液质量标准的提高提供依据。

西索米星发酵工艺条件的优化

考察了氯化钴、蛋氨酸、磷酸盐和可发酵糖对西索米星分批发酵的影响,优化了西索米星分批发酵工艺条件.研究表明,初始发酵培养基中添加6～10mg/L氯化钴或1.0～2.0g/L蛋氨酸有助于西索米星的合成,蛋氨酸在产物合成前期添加的效果最佳.高浓度磷酸盐会提高发酵液中淀粉水解酶活力和丙酮酸浓度、降低碱性磷酸酯酶活力和抑制西索米星的合成.应分段控制发酵液中的磷酸盐浓度,在菌体生长期应控制在3.14mmol/L以内,在产物合成期应控制在0.10mmol/L以下.与分批发酵过程相比,当以麦芽糖或淀粉水解液为补料液、将发酵液中可发酵糖浓度控制在8.5～11.5g/L时,不论采用变流率还是恒流率的流加发酵方式均有助于大幅度提高西索米星发酵水平.

抗生素西索米星发酵过程中次要组分的调控

在西索米星产生菌橄榄星孢小单孢菌Ｍ－４１的发酵代谢与产物合成的研究中，发现通过控制种子期菌丝的生长形态、培养基中磷酸盐含量，并在发酵过程中添加合适的抑制剂，可有效地减少发酵液中次要组分ｖｅｒｄａｍｉｃｉｎ的生物合成，增加主要组分西索米星的含量。

HPLC-ELSD法分析硫酸奈替米星与硫酸西索米星的含量与有关物质

目的:建立一种硫酸奈替米星与硫酸西索米星的含量及有关物质分析方法,为开辟氨基糖甙类抗生素含量测定及有关物质的分析方法提供新思路。方法:应用高效液相色谱-蒸发光散射检测法分析硫酸奈替米星与硫酸西索米星的含量及有关物质。色谱条件:C18 Luna色谱柱,规格:250mm×4.6mm,5μm;流动相:0.1mol.L-1三氟醋酸水溶液-0.1％(V／V)甲酸水溶液-甲醇(360:540:100)(硫酸奈替米星适用)0.1mol.L-1三氟醋酸水溶液-0.1％(V／V)甲酸水溶液-甲醇(372:558:70)(硫酸西索米星适用);检测器条件:漂移管温度为50℃,雾化气体(空气)压力为3.0bar。结果:硫酸奈替米星与硫酸西索米星样品中主成分与有关物质分别在各自色谱条件下均分离良好。结论:本方法操作简单,方法的准确性、重现性均能很好地满足质量控制的要求,为开辟氨基糖甙类抗生素含量测定及有关物质的仪器分析方法提供了一定借鉴。

pH值和温度对西索米星发酵的影响

西索米星发酵过程菌体生长和产物合成的最适发酵温度和pH值有所不同。菌体生长阶段发酵温度34℃和pH值7.1;产物合成阶段发酵温度31℃和pH值7.4的分段控制策略,有助于西索米星产生菌的菌体生长和产物合成。与在整个发酵周期内控制一种温度和不控制pH值的传统工艺相比,该策略可提高西索米星产量10%。