基于定量PCR方法初步分析西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌数量变化

运用实时荧光定量PCR方法分析西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌的数量变化规律,需要有效提取其微生物总基因组DNA。本文通过同时添加溶菌酶与溶壁酶优化实验方案,成功获得西藏开菲尔粒中微生物的总基因组DNA。荧光定量PCR分析提取自培养1、4、8和12周的西藏开菲尔粒的微生物总基因组DNA,结果显示:4个时间点细菌16S rRNA与酵母菌26S rRNA基因拷贝数均分别约为每微升107拷贝与105拷贝,表明细菌与酵母菌的数量相对稳定。该结果为进一步研究西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌间的共生关系奠定了一定的基础。

西藏开菲尔粒中酵母菌的分离与初步鉴定

西藏开菲尔粒（俗称藏灵菇）是由多种乳酸菌（间或少量醋酸菌）和酵母菌共生而成一种外形酷似菜花的白色或乳黄色团状聚合体,是目前已知的唯一可用于酸奶制作的天然野生菌种资源。采用扫描电镜、分离培养、26S rRNA基因测序与序列分析、荧光原位杂交（FISH）相结合的技术方法,对西藏开菲尔粒中的酵母菌进行了分离培养、鉴定和形态观察。结果显示：西藏开菲尔粒中酵母菌多为球形（2.0~5.0μm）或椭圆形（1.0~3.0×2.0~4.0μm）;从西藏开菲尔粒中分离出的16株酵母菌分属于酿酒酵母属（Saccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、亚罗酵母属（Yarrowia）这3个属中的4个种,其中3株是酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）,8株为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）,3株为解脂亚罗酵母菌（Yarrowia lipolytica）。

西藏开菲尔粒中Lactobacillus kefiri的分离与鉴定

Lb.kefiranofaciens是西藏开菲尔粒中的优势菌株,约占乳酸菌总数的95%。通过分离纯化,构建克隆文库并结合16S rRNA基因测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、菌落PCR和显微镜观察等手段分析了开菲尔粒中的非优势乳酸菌Lb.kefiri。扫描电镜显示,其细胞形态呈短杆状(0.8~1.5×0.6~0.7μm),比Lb.kefiranofaciens短,且细菌聚集生长的趋势更为明显。在所构建的克隆文库中,25个菌落经测序分析,发现有1条序列属于Lb.kefiri。以开菲尔粒为样品,通过分离纯化,应用菌落PCR方法验证的22个单菌落中,有5个单菌落是Lb.kefiri。此外,对开菲尔粒进行PCR-DGGE检测,发现4个开菲尔粒样品中都有Lb.kefiri的存在。这些结果都证明了Lb.kefiri在开菲尔粒中稳定存在且所占比例相对较小,是一种非优势乳酸菌。

西藏开菲尔粒发酵乳清粉贮藏稳定性及货架期预测

为了掌握一种通过真空冷冻干燥技术制备的西藏开菲尔粒发酵乳清粉的贮藏稳定性,对其120 d贮藏期理化指标、生化指标进行研究,并通过货架期预测方程来估计其在25℃、50%相对湿度(RH)条件下聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)包装的货架期。研究结果表明:在120 d的储藏期中,乳清粉中的水分含量、羟甲基糠醛(HMF)含量及硫代巴比妥酸(TBA)值均随着贮藏时间的延长而显著增加(p<0.01),乳糖含量和粗蛋白含量随贮藏时间的延长而显著降低(p<0.01),色差随时间的变化有轻微波动,但总体呈现增长的状态。实验测定西藏开菲尔粒乳清粉的货架期为105 d,与根据贮藏期公式得到的112.1 d接近,相对误差为6.76%,相对常见的乳清粉具有较长的货架期。