西部马脑炎病毒基因组序列的半套式RT-PCR检测

为进一步提高RT PCR检测西部马脑炎病毒 (WEE)病毒基因组方法的敏感性 ,采用半套式PCR扩增病毒基因组特异序列。首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA ,然后以此cDNA为模板 ,进行扩增。对扩增后电泳检查无可见DNA条带的产物进行半套式PCR ;与此同时对扩增的循环数、Mg++浓度和退火温度等条件进行了优化 ,以进一步提高扩增的特异性。结果第一轮PCR未扩出特异性片段的WEE病毒稀释度 ,其半套式扩增出特定大小的DNA产物 ;同时优化的条件提高了扩增产物的特异性。扩增产物约为 190bp的单一DNA片段 ,其大小与预期的相一致。结果表明采用半套式RT PCR方法检测WEE病毒的基因组序列的敏感性可提高 10

西部马脑炎病毒基因组序列的RT-PCR检测

目的 :建立敏感、特异的西部马脑炎 (westernequineencephalitis,WEE)病毒RT_PCR检测方法。方法 :首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA ,然后以此cDNA为模板 ,进行PCR扩增。并对PCR扩增过程中的模板量、循环数、Mg2 + 浓度、退火温度和延伸时间等条件进行优化 ,以提高检测的特异性和敏感性。结果 :采用经优化的条件进行PCR扩增获得了约 35 0bp的单一DNA片段 ,其大小与预期的相一致 ,且可自 0 .1TCID50 的病毒液中检测出WEE病毒基因组序列。结论 :所建立的RT_PCR方法可自病毒感染的小鼠脑组织和传代细胞中检测WEE病毒的基因组RNA。

西部马脑脊髓炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法建立及标准质控品制备

选取西部马脑炎病毒代表株进行序列比对分析，选择保守区域，设计合成引物和TaqMan探针。经对反应体系和条件进行优化，建立了检测西部马脑炎病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，应用建立的方法对西部马脑炎病毒核酸、东部马脑炎病毒核酸、马动脉炎病毒核酸、马疱疹病毒1型核酸、马流感病毒H3N8亚型核酸进行检测，结果表明建立的方法只能检出西部马脑炎病毒核酸，与另外4种病毒核酸无交叉反应。进一步通过体外转录制备了西部马脑炎病毒McMillan株7442-10011的cRNA片段，经拷贝数计算、稀释、分装、均匀性和稳定性检验后，作为质控品对建立的方法进行评价。结果显示，所建立的方法其分析灵敏度可达10拷贝。对197份进口马血样品检测用时仅4小时，表明该检测技术快速、灵敏、特异。因此，本研究建立的方法可作为技术储备用于进口马匹的疫病筛查。