基于成簇的规则间隔短回文重复序列的严重急性呼吸综合征冠状病毒2检测的最新进展

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎(COVID-19)迅速蔓延全球,给全球公共卫生系统带来了挑战。由于逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和抗原测试的普遍适用性和灵敏度较差,并且具有不同突变的SARS-CoV-2变体持续的出现,给疫情防控带来了更大的挑战,因此,高灵敏度、无需设备并且能够区分SARS-CoV-2变体的诊断方法亟须发展。基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的诊断对设备要求低,具有可编程性、灵敏性和易用性,已经发展出多种核酸检测工具用于传染病的诊断,其在临床上具有巨大的应用潜力。文章聚焦于近期发表的基于CRISPR实现SARS-CoV-2检测和变体区分的最新技术,总结其特点并对其发展进行了展望。

间隔同轴交叉扭带强化润滑油传热特性数值研究

滑油冷却器是核动力装置中一类不可或缺的换热器。运用强化传热技术可增强润滑油的传热、减小换热器的体积。为了增强传热管内润滑油的传热,本文提出了一种新型的规则间隔同轴交叉扭带。采用CFD方法,在间距率0.5~3.0的范围内,对圆管内插规则间隔同轴交叉扭带的管内传热系数与阻力系数进行了分析。结果表明,在雷诺数为40~1050的层流条件下,规则间隔同轴交叉扭带能够显著提高管内润滑油的对流传热系数,可达光管的2~5倍。而且,随着间距率的减小,虽然对流传热系数和阻力系数均随之增大,但是综合评价准则数仍随之增大。当间距率为0.5时,评价准则数最大可达2.98。

基于G语言的智能变电站五防规则生成方法

在智能化变电站中,五防系统的实施工作量大、效率低。介绍了在绘制全站一次接线图的过程中自动生成设备五防规则的方法,它能够将基于G语言的一次设备图形对象与基于IEC 61850的模型数据对象无缝对接,实现由一次设备的拓扑关系直接产生五防设备使用的规则文件,避免繁琐的规则库输入配置,对于提高智能变电站工程实施的效率与质量具有积极的意义。

基于重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas12a的青鱼物种快速鉴定研究

目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas12a快速鉴定方法,并对该方法的检测时间进行优化;同时,评估该方法的特异性和灵敏度,并对青鱼及其近缘物种的市售样品进行检测。结果 该方法仅需25 min完成检测;对青鱼物种的鉴定表现出显著的特异性,并对其近缘物种如草鱼、赤眼鳟、鳡鱼、倒刺鲃的检测结果均呈阴性;方法灵敏度为1.0×10-3ng/μL(以基因组DNA计);与DNA条形码技术相比,该方法在市售样品的检测结果上表现一致。结论 建立了青鱼物种的RAA-CRISPR/Cas12a现场快速检测方法,该方法具备快速、特异、灵敏的特点,为水产市场或野外环境中快速检测青鱼物种提供了技术手段。

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

基于CRISPR-Cas系统的光学信号传感检测策略综述

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR and CRISPR-associated system,CRISPR-Cas系统)是在大多数细菌和古菌中发现的一种获得性免疫系统,由Cas酶和引导RNA(guide RNA,gRNA)组成,根据gRNA序列的特异性识别并剪切靶标DNA或RNA。近年来,得益于CRISPR-Cas系统优异的酶切活性,建立了多种生物传感技术(biosensor),光学信号传感策略简单、便携,广泛应用于科学研究和实际应用中。详细总结了近五年来基于CRISPR-Cas系统的各种光学传感策略的基本原理以及代表性成果和应用。同时,也对当前的应用前景和挑战进行展望。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

重组酶介导的等温扩增结合CRISPR/Cas12a检测志贺氏菌和克罗诺杆菌

目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过筛选志贺氏菌和克罗诺杆菌特异性基因,设计特异扩增引物、CRISPR脱氧核糖核酸(CRISPR deoxyribonucleic acid,crDNA)和探针,将靶标进行RAA扩增后,建立CRISPR检测方法。对方法的灵敏度、特异性和应用性进行评价,并与国标检测方法进行对比。结果本研究对志贺氏菌和克罗诺杆菌纯菌液DNA最低检出限分别为4.9×10^(3) CFU/mL、4.4×10^(4) CFU/mL,基因组DNA最低检出限为6.8×10^(‒3) ng/μL、5.7×10^(‒3 )ng/μL,特异性好,与其他病原菌无交叉反应。同时,该方法成功检测出加标猪肉样品和人工污染奶粉中的志贺氏菌和克罗诺杆菌,比国家标准检出限更低。结论本研究建立的RAA-CRISPR方法可有效应用于志贺氏菌和克罗诺杆菌的检测,这为快速筛查食品中是否污染这两种病原菌提供重要价值。

基于RPA-CRISPR-Cas12a和聚噻吩显色技术快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS

目的开发基于重组酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated 12a protein,CRISPR-Cas12a)和聚噻吩显色技术快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS的方法。方法利用Cas12a附属切割机制进行精准识别RPA产物中的靶标,结合阳离子水溶性共轭聚噻吩(cationic water-soluble conjugated polythiophene,PMNT)与体系中单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)的颜色变化检测转基因产品中耐除草剂草甘膦CP4-EPSPS抗性基因。结果167 bp的RPA引物进行扩增时,扩增体系为20μL时条带最清晰;ssDNA的碱基数为15,Cas12a酶的浓度为0.28 U为最优组合。进行RPA-CRISPR-Cas12a反应后,加入PMNT溶液,裸眼观察是溶液从红色变为黄色,紫外下照射下则颜色为橘红色变为橙黄色,检出限为45拷贝。结论构建了一种基于PMNT颜色变化进行转基因产品的CRISPR-Cas12a的检测方法,30 min内完成整个检测过程,仅需要恒温加热可实现快速灵敏、可视化的检测。

CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类细胞及胚胎Rb1基因编辑的研究

目的探索聚簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对于食蟹猴细胞及胚胎基因组视网膜母细胞瘤抑癌基因(Rb1)的编辑效率,旨在进一步建立视网膜母细胞瘤模型。方法查阅RB1突变数据库(http://rb1-lsdb.d-lohmann.de),确定视母细胞瘤发生发展相关Rb1基因外显子区主要有8号外显子;利用DNAman检测人类与食蟹猴基因组中Rb1基因中与是否存在单核苷酸多态性(SNP);通过http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html设计并合成sgRNA;采用CRISPR/Cas9基因编辑系统转染食蟹猴成纤维细胞,并提取转染后细胞基因组以检测合成的sgRNA敲除效率;酶切实验检测转染的细胞是否发生突变,并利用单克隆分析测定具体敲除效率。进一步利用显微操作技术注射sgRNA和Cas9 nuclease混合物(RNP)入单细胞胚胎,检测胚胎水平Rb1基因编辑效率。结果 RNP转染后的食蟹猴成纤维细胞提取基因组检测,发现其中有75%的细胞发生基因突变,且基因编辑类型多样,以碱基缺失突变为主;在胚胎水平上获取4-细胞期胚胎,检测单个卵裂球基因组序列发现,存在突变的胚胎占所有胚胎的36.4%,其中纯合突变比例为18.2%,嵌合突变比例同为18.2%。利用软件预测脱靶位点12个,进行序列测定,结果未发现脱靶。结论在非人灵长类细胞及胚胎水平上,CRISPR/Cas9基因编辑系统对于食蟹猴Rb1基因编辑有效,并且敲除效率较高,进一步利用基因编辑方法建立视网膜母细胞瘤模型研究中,可以作为有效的基因编辑手段。本研究得到的食蟹猴胚胎Rb1基因的编辑效率及胚胎囊胚率为建立视网膜母细胞瘤模型提供了参考。

靶向非洲猪瘟病毒EP152R基因sgRNA细胞系的构建及其对ASFV复制影响的研究

有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt~72845nt)的sg RNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sg RNA的编辑效率确定最佳sg RNA。结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sg RNA,其中3对sg RNA对EP152R基因的编辑效率达30%~42%,另外两对sg RNA的编辑效率低于10%。将筛选的3对sg RNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sg RNA的细胞WSL-g REP152R,并采用western blot鉴定。结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sg RNA的细胞系WSL-g REP152R-1/2/3。将携带m Cherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-g REP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h)。观察结果显示,随感染时间的延长WSL-g REP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-g REP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者。q PCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-g REP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-g REP152R-2中的病毒效价最低。将m Cherry-ASFV感染各WSLg REP152R细胞并连续传3代,采用q PCR检测F2、F3代细胞上清液中的病毒扩增的Ct值。结果显示,与WSL细胞相比,各WSL-g REP152R细胞F2代上清液中ASFV扩增的Ct值均极显著升高(P<0.01),且WSL-g REP152R-2 F2代及WSL-g REP152R-1/2 F3代细胞上清液中均检测不到病毒扩增的Ct值。上述结果表明,本研究设计的sg RNA能够有效靶向ASFV EP152R基因并敲除该基因进而抑制ASFV及其子代病毒的复制,且g REP152R-2抑制ASFV复制的效果最好。本研究为ASFV疫苗的开发及抗ASF育种猪提供重要参考数据。

CRISPR/Cas技术在乳酸菌中的研究进展

乳酸菌是重要的食品发酵剂,其传统的基因遗传操作技术为同源重组,该技术为后续的基因编辑工作奠定了基础,但是也存在操作繁琐、效率低等不足。成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)以其高效、便捷性推动了乳酸菌基因编辑的发展。该文综述了CRISPR的原理、分类,重点阐述了CRISPR操作系统在乳酸菌方面的应用。

非病毒纳米载体递送CRISPR/Cas9的研究进展

成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)技术目前广泛应用于生命医学领域的基础研究及临床应用研究。由于载体在CRISPR/Cas9技术中发挥了重要的作用,如何进一步开发和优化载体系统具有重要的意义。传统的载体大多以病毒载体为主,其递送的效率高,但亦存在插入片段的大小有限、免疫反应、致癌、难以大规模生产甚至脱靶等缺陷;而非病毒纳米载体在一定程度上可解决基因编辑过程中由病毒载体所带来的潜在毒性和容量限制等问题,可能具有更广阔的应用前景。本文主要综述了目前用于CRISPR/Cas9系统递送的非病毒纳米载体,探讨了非病毒纳米载体在递送CRISPR/Cas9系统时可能遇到的主要困难,提出了相应的解决方案和策略,以期为基因治疗和药物研发提供新的参考依据。

基于CRISPR/Cas工具的肿瘤基因线路构建及应用

以恶性肿瘤为代表的难治性疾病仍是困扰我国乃至全球的一个重大公共卫生问题。近年来,合成生物学的蓬勃发展,极大推动了疾病创新治疗策略,并显示出巨大潜力。人工构建的基因线路可特异性地识别、区分疾病细胞和正常细胞,并控制疾病细胞命运,为精准治疗提供了新途径。然而构建基因线路用于疾病治疗的挑战之一是缺乏有效、可编程、安全和序列特异性的基因编辑工具。CRISPR/Cas自从首次被用于哺乳动物基因编辑以来,已被广泛应用于研究、工业和医学领域。除Cas9诱导的indel突变外,CRISPR/Cas能够进行DNA/RNA的碱基编辑,为基因线路设计提供了高效的工具,极大提高了每个线路元件效率。因此,基于CRISPR技术的智能化基因线路的应用,可有效保证癌症等疾病治疗的安全性、高效性和特异性。本文介绍了CRISPR/Cas技术应用于医学合成生物学基因线路设计的研究进展和潜在挑战。评估了使用CRISPR系统元件的合成基因线路在肿瘤治疗中的效果,尤其利用人工开关诱导的Cas9干预肿瘤细胞治疗的安全性和有效性;介绍了CRISPR/Cas9介导的信号传感器设计,其可同时识别多个蛋白质信号,实现了多基因同步调控,以及新一代体系小、特异性强、基因调控效率高的CRISPR/Cas12a系统及其遗传改造。基于无启动子表达CRISPReader元件的精简基因线路设计,其高效启动的特点极大提升了智能化基因线路在未来精准癌症治疗中的应用潜力。

益生菌的功能基因导入和基因编辑

益生菌已经在临床和食品领域应用多年,其安全性和有效性已经获得人们的认可。随着分子生物学技术的发展,采用益生菌作为载体进行基因导入或基因编辑,这些遗传改造的益生菌一部分已经作为新的药品或疫苗进入到临床应用阶段。携带功能基因的益生菌定殖于肠道进行表达和缓慢释放,这类益生菌作为活体药物获得益生菌和功能基因的双重功效,可用于治疗某些疑难病症。携带蛋白质抗原基因的益生菌定殖于肠道进行表达,可诱导肠道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫,这是一条更安全的口服疫苗途径。成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)以其高效与便捷性推动了益生菌基因编辑的发展。这篇综述介绍了CRISPR-Cas9操作系统在益生菌方面的应用。对传统遗传操作较难的益生菌采用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑,使其基因敲除和基因突变,基因敲入和基因调控等更为简单、高效和易操作。这些CRISPR/Cas9、CRISPRa和CRISPRi技术在益生菌的基因表达调控和代谢工程等领域具有巨大的应用潜力,例如医药、食品以及工业等相关重要产品的获得。本文总结了益生菌基因导入和基因编辑在生物制品生产中的相关应用,最后对其未来的研究方向进行展望。

基因编辑背景下的肿瘤生物治疗新策略和挑战

CRISPR等基因编辑技术在多学科、多领域产生了革命性影响,也极大地推动了肿瘤生物治疗研究方法的转变和治疗新策略的形成。在肿瘤研究中,基因编辑加速了肿瘤细胞和免疫细胞中生物治疗新靶点的发现,推动了癌基因、抑癌基因、表观分子、耐药基因等“肿瘤细胞正常化”靶向编辑新策略的提出,促进了CAR-T、TCR-T细胞等过继细胞治疗方法向“通用型”、“即用型”的迭代,也极大地加速了CAR-T细胞等细胞治疗的临床应用。通过更加精准基因编辑系统的研发、基因递送策略的不断进步,以及多靶点编辑、定点插入和体内时空可控编辑的发展,将进一步降低基因编辑的脱靶效应,提高疗效和安全性,同时控制成本,推动基因编辑在肿瘤生物治疗中更加广泛的应用,且有望在实体瘤治疗方面实现新的突破。

基于环介导等温扩增技术及规则成簇间隔短回文重复序列的日本血吸虫核酸检测方法的建立及评价

目的 建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法。方法 以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列,设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针,建立并优化LAMPCRISPR反应体系。用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒,不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA,评价其灵敏度和特异度。用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本,并与LAMP检测结果比较,以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果。结果 建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段。其最适反应温度为37℃,反应体系中gRNA的最佳反应浓度为40 nmol/L,Cas12a蛋白的最佳反应浓度为40 nmol/L。该方法与肝片形吸虫等蠕虫基因组DNA均无交叉反应;以10倍梯度稀释的重组质粒为模板,该方法检测限为10拷贝/μL;此外,该方法能够准确检测出日本血吸虫虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫及成虫基因组DNA。45份钉螺样本检测结果显示,LAMP-CRISPR与LAMP检测感染性钉螺的结果差异无统计学意义(χ^(2)=0.05,P>0.05);与金标准比较,LAMP-CRISPR方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为96.67%(29/30),LAMP方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为93.33%(28/30)。结论 本研究建立了一种灵敏性和特异性均较高的基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫核酸检测方法,具有用于日本血吸虫感染快速检测及风险监测的潜力。

基于核酸靶标免扩增CRISPR/Cas体系的分子速测技术研究进展

快速准确的分子诊断在食品安全、疾病诊断、环境监测等生命科学领域发挥重要作用。成簇规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas系统因具有高灵敏度、高特异性、便捷性及快速等优势,已成为精确检测核酸靶标的重要分子诊断工具。基于CRISPR/Cas系统的检测通过预扩增步骤提高靶标浓度,但也随之带来气溶胶污染、操作复杂和检测周期长等问题。因此需要积极开发更多免扩增策略,在最大限度保证灵敏度的同时,一步式实现对靶标的检测。综述了免扩增CRISPR系统的重要性,重点阐述了反应影响因素及相关策略对体系的优化作用,以及数字芯片法、表面增强拉曼光谱法和电化学金属电极法对信号放大效果的前沿进展,并对CRISPR/Cas系统的即时检测应用进行展望,以期为免扩增CRISPR/Cas检测系统的发展提供理论指导。

基于CRISPR/Cas9技术治疗G6PD缺乏症的运用前景

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是由于G6PD基因突变引起的X连锁最常见的血液系统遗传疾病,目前的治疗以预防为主,严重者采用对症治疗。在基因水平上修复其突变位点将极大地改善这一现状,具有较好的应用前景。最新的基因编辑技术,即成簇规则间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)可通过同源性指导的修复来修正突变基因。这项技术正在体外应用于人类诱导多能干细胞(iPSCs)中,以纠正多种严重的遗传疾病,但目前鲜见用于G6PD缺乏症的治疗研究。本文重点介绍新型基因编辑技术CRISPR/Cas9治疗G6PD缺乏症的可行性和运用前景。

GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探

本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞,潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记,通过单细胞克隆的方式进一步培养,PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞,最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况,验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化,发现其CD34^(+)、CD43^(+)及CD45^(+)细胞增多,但GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞显著减少,通过转座子系统过表达GATA1也不能挽救其减少的GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞。本研究建立了GATA1s敲除hPSCs细胞株,并发现其在造血分化时有重要作用。