改良的人视网膜Muller细胞的原代培养方法与鉴定

背景视网膜Muller细胞是视网膜重要的胶质细胞，也是视网膜干细胞的来源之一，研究Muller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义，而建立稳定的视网膜Muller细胞培养体系是相关研究的基础。目的优化分离培养和纯化人视网膜Muller细胞的方法，为相关的实验研究提供良好优质的Muller细胞来源。方法分离人供体眼视网膜组织，然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0．25％胰蛋白酶＋100U透明质酸酶混合溶液中进行消化，添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM／F12培养液1～2ml终止消化，然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72h，行半量换液，再以含10％胎牛血清的培养液进行传代。光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定，并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Muller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶（GS）的表达，对培养的细胞进行鉴定。结果应用0．25％胰蛋白酶＋100U（商品单位）透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Muller细胞，原代培养后24h细胞贴壁，培养后9—10d细胞融合。培养的细胞胞体呈长圆形，细胞质丰富，部分细胞体两端锥状长突起，末端膨隆，细胞核大。传代后的细胞胞体大，呈扁平多角形，符合Muller细胞的形态。细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达，90％以上的细胞中GS呈强阳性表达。结论应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Muller细胞，分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPM11640培养液培养和传代的人视网膜Muller细胞产量高且纯度好。

新生小牛视网膜水平细胞生长发育特性的体外实验

目的:研究新生小牛视网膜水平细胞在体外培养中的生长发育规律。方法:分离培养新生小牛视网膜神经细胞,将培养10、20、30和40d的细胞进行免疫细胞化学染色,采用CalbindinD28K抗体标记视网膜水平细胞,用图像分析系统定量测量阳性细胞的免疫反应强度。结果:培养10d的水平细胞还不具备典型的形态特征,培养20d时阳性细胞的形态特征与成熟的水平细胞一致。培养30d和40d的水平细胞的形态特点和培养20d时相似。定量分析显示体外培养20d时阳性细胞免疫反应强度较10d时有增加趋势。体外培养30d和40d时,阳性的水平细胞免疫反应强度较培养10d和20d时均明显减弱。结论:体外培养20d的视网膜水平细胞具备成熟的形态特征,免疫反应强度较强,是发育良好的神经元。

牛视网膜毛细血管周细胞的原代培养

目的:建立牛视网膜毛细血管周细胞原代培养的方法。方法:以酶消化法原代培养牛视网膜毛细血管周细胞,用透射电镜和免疫细胞化学法对细胞进行鉴定。结果:培养的周细胞贴壁生长,胞体肥大,呈不规则状、有较多突起。细胞生长缓慢,呈现非接触抑制的重叠状生长。电镜下周细胞核大、不规则、有切迹,可见多个核仁。细胞表面有微绒毛,胞质内有丰富的细胞器,无Ⅷ因子小体;免疫细胞化学显示细胞呈平滑肌肌动蛋白(-αSMA)阳性,Ⅷ因子相关抗原阴性。结论:酶消化法原代培养牛视网膜周细胞是一种稳定、可靠的方法。

银杏叶注射液对牛视网膜毛细血管周细胞的保护作用

目的:研究糖基化终产物(AGEs)和银杏叶注射液对体外培养的牛视网膜毛细血管周细胞增殖、细胞周期和转化生长因子β(TGF- β)表达的影响,观察银杏叶注射液对周细胞的保护作用。方法:应用MTT比色分析法、流式细胞术及免疫荧光检测等方法进行分析。结果:银杏叶注射液能促进AGEs作用下周细胞的增殖,浓度12 5～4 0 0 mg·L- 1 的银杏叶能明显促进AGEs作用下周细胞的增殖(P<0 .0 1) ,呈剂量依赖性。银杏叶注射液能明显抑制AGEs对周细胞细胞周期的影响及其促进凋亡的作用,使周细胞S期细胞减少,G2 - M期细胞增多,凋亡细胞数下降(P<0 .0 1) ,并能降低AGEs诱导周细胞TGF- β的表达。结论:AGEs可通过氧化应激对视网膜微血管周细胞产生损伤,应用抗氧化剂银杏叶注射液可以减少AGEs对周细胞的毒性作用。

丝裂原细胞外信号反应激酶阻断剂对缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:观察特异性丝裂原细胞外信号反应激酶1(MEK1)阻断剂(PD98059)对缺氧刺激的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法:实验于2004-11/2005-11在江苏省人民医院中心实验室完成。①利用体积分数为0.95的N2和0.05的CO2混合气体建立培养的人视网膜色素上皮细胞细胞缺氧模型。②用3种不同浓度(10,50和100μmol/L)的P42/P44MAPK特异性阻断剂PD98059处理视网膜色素上皮细胞细胞。③在缺氧24h后用四甲基偶氮唑盐的方法检测细胞的增殖情况。④用反转录-聚合酶链反应的方法检测周期蛋白DmRNA的表达。⑤收集细胞进行流式细胞仪的检测,判断细胞的周期情况。结果:①缺氧刺激24h后视网膜色素上皮细胞增殖,缺氧组比正常组增加4.71%。②PD98059对视网膜色素上皮细胞细胞增殖有明显的抑制作用,并具有浓度依赖性;与缺氧组相比,缺氧+10mmol/L组、缺氧+50mmol/L组及缺氧+100mmol/L组抑制率分别是5.11%,11.66%和16.36%。③缺氧24h后,细胞周期蛋白DmRNA的浓度明显增加,不同浓度的PD98059对周期蛋白D的mRNA生成有明显的抑制作用,并且呈浓度依赖性,缺氧组与正常组比较周期蛋白D增加26.67%,与缺氧组比较,缺氧+10mmol/L组、缺氧+50mmol/L组及缺氧+100mmol/L组抑制率分别为18.93%,37.72%,57.58%。④缺氧时DNA合成前期细胞明显增多,细胞的增殖减少。结论:P42/P44MAPK信号转导通路可能通过对周期蛋白D的影响抑制缺氧时视网膜色素上皮细胞的增殖。

细胞周期蛋白激酶抑制因子p21和p27在兔视网膜中的表达与细胞增生的关系

背景细胞周期调节不平衡可诱发增生性玻璃体视网膜病变（PVR），研究周期蛋白依赖性激酶（CDK）及其抑制因子（CKI）对PVR形成过程中视网膜色素上皮（RPE）细胞和成纤维细胞病理增生过程中细胞周期的调控对PVR的防治具有重要意义。目的研究CKIp21和p27在不同发育阶段正常兔视网膜中的表达规律，探讨p21和p27表达与细胞生长的关系。方法按照兔龄将9只新西兰白兔分为10周龄组、20周龄组和30周龄组，每组3只。实验兔处死后取出双眼分别用于p21和p27在转录水平和翻译水平表达的检测。分离视网膜组织，采用real-timePCR和Westernblot法分别检测不同周龄兔视网膜中p21和p27mRNA及其蛋白的表达变化。结果10周龄组、20周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21mRNA的相对表达量分别为1．631±0．063、1．506±0．012和1．585±0．015，p27mRNA的相对表达量分别为1．581±0．048、1．470±0．012和1．490±0．013，总体比较差异均有统计学意义（p21：F=9．311，P=0．014；p27：F=12．360，P=0．007），其中10周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21和p27mRNA的表达量均明显高于20周龄组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。10周龄组、20周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21蛋白的相对表达量分别为0．675±O．061、0．089±0．001和0．200±0．007，p27蛋白的相对表达量分别为0．928±O．019、0．183±0．005和0．576±0．089，总体比较差异均有统计学意义（p21：F=228．905，P〈0．001；p27：F=148．957，P〈0．001），其中10周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21和p27蛋白的表达量均明显高于20周龄组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。兔视网膜中p21与p27间mRNA及蛋白的相对表达量均呈正相关（mRNA：r=0．906，P〈0．01；蛋白：r=0．913，P〈0．01）。结论p21和p27在生长发育期的兔视网膜中表达量升高，随着生长过程变缓其表达量降低，之后随着视网膜组织老年性变化发生病理性表达增加，在细胞周期调控过程中可能起着平衡作用。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1／VEGF信号通路的抑制作用

背景视网膜新生血管（RNV）是多种眼底血管疾病的共同表现，研究证实胰岛素样生长因子（IGF-1）能够刺激血管内皮细胞的增生，从而促进新生血管的形成，而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用。但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚。目的研究PSF对IGF-1／血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的调控作用。方法将猕猴视网膜血管内皮细胞RF／6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil．PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组，分别在细胞中转人真核质粒Pegfp—C2-PSF、pGenesil—PSF—RNAi及相应的空白质粒。各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1（IGF-1）以刺激细胞生长，采用MTT法检测各组RF／6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量，用于进一步的实验。采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF／6A细胞中VEGFmRNA的表达；采用Westernblot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶（ERK）活化的促进作用。结果IGF-1刺激后Pegfp．C2．PSF质粒转染组以0．50IxgPSF为最适剂量，其RF／6A细胞的增生率为0．220±0．020，细胞中VEGFmRNA相对表达量为0．79±0．07，分别低于其对照组的0．260±0．006和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．040、0．016）；IGF-1刺激后pGenesil—PSF—RNAi质粒转染组以1．00IxgPSF作为最适剂量，其RF／6A细胞增生率为0．35±0．02，VEGFmRNA相对表达量为2．29＋0．43，分别高于其对照组的0．210-4-0．019和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．003、0．019）。IGF-1刺激后1、3、6hPegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组，差异均有统计学意义（P=0．017、0．000、0．000）。Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126’处理后细胞中VEGFmRNA的相对表达量为0．93±0．21，明显低于未转染组的1．32±0．08，差异均有统计学意义（P=0．037），同时明显低于Pegfp—C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGFmRNA的相对表达量1．23±0．09，差异有统计学意义（P=0．002）。结论PSF可抑制IGF-1诱导的RF／6A细胞中的ERK信号通路的活化，下调VEGF在RF／6A细胞中的表达，进而抑制RF／6A细胞的增生。

姜黄素对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的观察姜黄素对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞（RRVEC）凋亡的影响。方法取对数生长期原代培养的第4代RRVEC进行实验，采用免疫荧光染色法鉴定培养的细胞，并对内皮细胞的特异性标志物血管性假性血友病因子（vWF）的表达进行检测。将培养的RRVEC分为对照组、高糖组和姜黄素干预组。对照组细胞正常培养。高糖组细胞经30mmol／L的葡萄糖培养。姜黄素干预组细胞经30mmol／L的葡萄糖培养24h后，再加入30μmol／L姜黄素处理24h。采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧（ROS）相对含量及细胞凋亡的变化情况。采用免疫细胞化学染色法检测各组细胞中核因子（NF）．rd3p65的蛋白表达。采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中B细胞淋巴瘤／白血病．2（Bcl-2）、Bcl-2相关x蛋白（Bax）的蛋白表达。结果分离得到的RRVEC在1周后呈铺路石样单层贴壁生长。培养获得的细胞vWF表达呈强阳性。对照组、高糖组及姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量、细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=40．957、325．137，P=0．000、0．000）。与对照组比较，高糖组RRVEC中ROS相对含量、细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（t=8．677、25．500，P=0．000、0．000）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量、细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（t=6．568、12．818，P=0．000、0．000）。与对照组比较，高糖组RRVEC中NF．r,Bp65（t=8．322，P=0．000）、Bax（t=3．813，P=0．009）蛋白表达明显增加，Bc1-2蛋白表达（t=4．362，P=0．005）及Bcl-2／Bax值（t=6．449，P=-0．001）明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中NF．1cBp65、Bax（f=2．577、3．059，P=-0．042、0．022）蛋白表达明显降低，Bcl-2／Bax比值（t=3．831，P=0．009）明显提高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论姜黄素能抑制高糖诱导的RRVEC凋亡，其机制可能与增强Bc1-2表达、下调Bax表达从而抑制NF．心信号通路有关。

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景白细胞介素-1β（IL-1β）是增生性玻璃体视网膜病变（PVR）早期释放的重要炎性因子，研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生，但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚。目的观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响，探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响。方法采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验，在无血清DMEM培养基中分别添加0、0．1、1．0和10．0μg／L的IL-1β作用于细胞24h，分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2（COX-2）蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度。将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素＋IL-1β组，分别在无血清培养基中添加1．0μg／L IL-1β和1．0μg／L IL-1β联合10μg／ml姜黄素作用于细胞24、48和72h，仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组。培养的细胞行苏木精-伊红染色，于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数，比较各组细胞的移行能力；分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量，采用Westernblot法检测并比较各组细胞中核因子-κB p65（NF—κB p65）蛋白和核因子κB抑制蛋白-α（IκB—α）的相对表达量；采用免疫化学染色法检测NF—κB p65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位。结果初分离的兔RPE细胞呈球形，细胞中可见大量黑色素颗粒；第4代细胞色素颗粒明显减少，接近融合的细胞形态为长梭形，呈拉网状分布。免疫细胞化学染色法结果显示，细胞角蛋白（AE1／AE3）在细胞质呈阳性表达。对照组在培养24、48和72h移行的细胞数分别为（31．93±1．21）、（36．27±2．50）和（38．33±2．40）个，IL-1β组分别为（45．73±2．30）、（71．13±1．92）和（80．60±1．71）个，而姜黄素＋IL-1β组分别为（13．13±2．20）、（14．93±1．10）和（12．60±1．51）个，各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组，而姜黄素＋IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。IL-1β质量浓度为1．0μg/L时，RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰，以1．0μg／L IL-1β的剂量进行后续实验。细胞培养后24、48和72h，姜黄素＋IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。IL-1β作用于细胞后48h，细胞中NF—κB p65蛋白的相对表达量最高，与IL-1β组相比，各时间点姜黄素＋IL-1β组细胞中NF—κB p65蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。IL-1β组药物作用于细胞后48h细胞中IκB—α降至最低，各时间点姜黄素＋IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。免疫细胞染色结果显示，IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF—κB p65呈强阳性表达，对照组表达较弱，姜黄素＋IL-1β组细胞中NF—κB p65的表达强度较IL-1β组明显降低；与对照组相比，IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱，而COX-2表达明显增强；与IL-1β组比较，姜黄素＋IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强，而COX-2表达明显减弱。结论姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行，IL-1β通过激活NF—κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达，姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达，从而发挥抗炎作用。

转甲状腺素蛋白对视网膜微血管内皮细胞生物学行为的影响

目的：观察转甲状腺素蛋白（TTR）对视网膜微血管内皮细胞（RMVEC）生物学行为的影响。方法培养的 RMVEC 依照 TTR 浓度不同分为0（初始浓度）、4μmol/L 组。培养48 h 后,噻唑蓝（MTT）比色法、细胞迁移实验分别检测不同浓度 TTR 对 RMVEC 增生、迁移的影响。细胞划痕实验检测培养0（初始时间）、24、48 h 时细胞损伤愈合情况。结果MMT 比色法检测结果显示,初始浓度组、4μmol/L 组吸光度[A,旧称光密度（OD）]值分别为0.17±0.02、0.40±0.03。两组 A 值比较,差异有统计学意义（t =15.47,P =0.0001）。细胞迁移实验结果显示,初始浓度组、4μmol/L 组 RMVEC 向外迁移数分别为（140±7）、（227±14）个。两组间 RMVEC 向外迁移数比较,差异有统计学意义（t=5.44,P =0.0006）。细胞划痕实验结果显示,初始时间各组细胞划痕距离大致相等；24 h,初始浓度组、4μmol/L 组细胞划痕愈合距离分别为（134.4±45.4）、（330.0±23.1）μm。两组细胞划痕愈合距离比较,差异有统计学意义（t =8.25,P 〈0.01）。48 h,4μmol/L 组完全愈合,初始浓度组未愈合。结论TTR 对 RMVEC 增生、迁移和损伤愈合有明显促进作用。

精氨酸酶抑制剂对体外高糖培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞的保护作用

目的 观察精氨酸酶（Arg）抑制剂N羟基-正-Ｌ精氨酸（nor-NOHA）对体外高糖培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞（RF/6A细胞）的保护作用。 方法 体外培养RF/6A细胞，并将其分为正常对照组（A组）、高糖对照组（B组）、高糖＋nor-NOHA处理组（C组）、高糖＋二甲基亚砜（DMSO）对照组（D组）。A组细胞以5.5 mmol/L葡萄糖继续培养；B～D组以25.0 mmol/L葡萄糖继续培养，C、D组分别加入125 mg/L的nor-NOHA及1%DMSO。采用噻唑蓝比色法、Transwell小室法和体外成管实验分别检测各组RF/6A细胞增生、迁移和管腔形成能力。采用荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组RF/6A细胞中ArgⅠ、内皮型一氧化氮（NO）合酶（eNOS）、诱导型NO合酶（iNOS）的mRNA相对表达量。采用酶链免疫吸附测定试验（ELISA）检测各组RF/6A细胞培养上清液中NO和白细胞介素（IL）-1b的分泌量。 结果 B组RF/6A细胞增生、凋亡及管腔形成能力较A组明显降低，差异有统计学意义（t=2.367、5.633、7.045，P＜0.05）；C组RF/6A细胞增生、凋亡及管腔形成能力较B组提高，差异有统计学意义（t=5.260、6.952、8.875，P＜0.05）。RT-PCR检测结果显示，与A组比较，B组RF/6A细胞中ArgⅠ、iNOS mRNA相对表达量升高（t=6.836、3.342），C组RF/6A细胞中ArgⅠ、iNOS mRNA相对表达量降低（t=4.904、7.192），差异均有统计学意义（P＜0.05）；B组RF/6A细胞中eNOS mRNA相对表达量降低（t=4.165），C组RF/6A细胞中eNOS mRNA相对表达量升高（t=6.594），差异均有统计学意义（P＜0.05）。ELISA检测结果显示，与A组比较，B组RF/6A细胞培养上清液中NO分泌量减少（t=4.925），C组RF/6A细胞培养上清液中NO分泌量增多（t=5.368），差异均有统计学意义（P＜0.05）；B组RF/6A细胞培养上清液中IL-1b分泌量增多（t=5.032），C组RF/6A细胞培养上清液中IL-1b分泌量减少（t=7.792），差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 nor-NOHA对体外高糖培养的RF/6A细胞有保护作用，可提高其增生、迁移及管腔形成能力；其机制可能是通过平衡Arg/NOS的表达从而抑制氧化应激反应。

高糖状态下视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析

目的观察高糖状态下视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析结果。方法体外培养视网膜血管内皮细胞，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为对照组、高糖组，两组细胞分别采用5、25 mmol/L的葡萄糖持续培养48 h。应用RNA-Seq技术对两组细胞进行全转录组测序，获得生物学大数据，并在此基础上分析差异表达基因；通过GO功能、Pathway显著性富集分析对差异基因的功能及所在的信号通路进行解释说明。结果对照组和高糖组之间共有449个差异表达基因。其中，上调基因297个，下调基因152个。差异基因功能涉及分子生物学过程调控以及细胞的能量代谢、蛋白合成等诸多方面，其中ITGB1BP2、NCF1、UNC5C等与炎症的产生相关；AKR1C4、ATP1A3、CHST5、LCTL等与细胞的能量代谢相关；DAB1、PRSS55等与蛋白合成相关；SMAD9、BMP4等与细胞外基质的代谢相关。GO功能显著性富集分析结果显示，差异基因的功能主要可以划分为生物学行为调控，细胞组分形成以及分子功能三大板块，主要集中表现在生物学过程部分的系统形成和调节多细胞有机体的形成等。Pathway显著性富集分析前20条具有明显差异的通路，发现差异表达比较明显的是转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、补体通路等，色氨酸、丝氨酸、氰氨酸等与氨基酸代谢相关的通路也受到了影响。其中，白细胞抑制因子9、骨形成蛋白4通过TGF-β信号通路发挥作用。结论高糖通过破坏视网膜血管内皮细胞的跨膜传导、细胞外基质代谢以及蛋白质的转录和翻译等，从而影响视网膜血管内皮细胞的功能。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。

抗血管内皮生长因子药物治疗后视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA—Seq分析

目的 观察抗血管内皮生长因子（VEGF）药物治疗后视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析结果.方法 体外培养视网膜血管内皮细胞,取对数生长期细胞用于实验.将细胞分为VEGF组、VEGF联合抗VEGF药物组.VEGF组细胞采用50 ng/ml VEGF持续作用72 h,以模拟糖尿病视网膜病变中血管内皮细胞的高VEGF生存环境.VEGF联合抗VEGF药物组细胞采用50 ng/ml VEGF＋2.5 μg/ml抗VEGF药物持续作用72 h,以仿效抗VEGF药物治疗后细胞所处的微环境.应用RNA-Seq技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,并在此基础上分析差异表达基因;通过GO功能、Pathway显著性富集分析对差异基因的功能及所在的信号通路进行解释说明.结果 分别获得两组细胞的基因表达谱信息.两组细胞之间共存在328个差异表达基因,包括194个上调基因和133个下调基因.差异基因功能涉及分子生物学过程调控以及细胞的能量代谢、蛋白合成等诸多方面,其中SI、PRX、HPGD与蛋白合成相关,BIRC7与细胞凋亡相关,而ABLIM1、CRB2与视网膜发育相关,ABCG1、ABCA9、ABCA12与巨噬细胞胆固醇和磷脂转运相关.GO功能显著性富集分析结果显示,差异基因的功能主要可以划分为生物学行为调控、细胞组分形成以及分子功能三大板块.Pathway显著性富集分析结果显示,Notch信号通路、细胞外基质受体通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、Wnt信号通路表达在两组细胞间存在差异,而其中又以与纤维化进程调控密切相关的TGF-β信号通路中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ（CAMK2B）、胶原蛋白Ⅲ型α1链（COL3A1）、细胞球蛋白（CYGB）、前列腺素E受体2（PTGER2）、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2等基因的差异表达最为引人关注.结论 抗VEGF药物治疗后可能导致CAMK2B、COL3A1、CYGB、PTGER2等TGF-β通路相关基因的表达上调进而加剧视网膜纤维化进程.

结缔组织生长因子重组干扰载体慢病毒颗粒的构建及其对视网膜血管内皮细胞内源性结缔组织生长因子表达的抑制作用

目的构建结缔组织生长因子（CTGF）重组干扰载体（shRNA），观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。 方法构建人源CTGF shRNA，应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞，利用干扰载体中的红色荧光标记示踪并筛选慢病毒的最佳感染复数及起效时间。将细胞分为空白对照组（正常培养）、感染对照组（Scramble shRNA病毒感染）及CTGF敲低组（CTGF shRNA病毒感染）。通过Transwell细胞迁移实验观察3组细胞的迁移能力；实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测3组细胞的结缔组织生长因子（CTGF）、纤连蛋白（FN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）的mRNA和蛋白表达。3组间数据比较采用方差分析。 结果CTGF shRNA的最佳感染复数为20，最佳起效时间是72 h。Transwell细胞迁移实验结果显示，CTGF敲低组穿过小孔细胞数较空白对照组及感染对照组明显降低，差异均有统计学意义（F=20.64，P=0.002）。实时定量PCR及Western blot检测结果显示，CTGF敲低组CTGF、FN、α-SMA、ColⅠ mRNA（F=128.83、124.44、144.76、1 374.44，P=0.000、0.000、0.000、0.000）和蛋白表达（F=22.55、41.60、25.73、161.68，P=0.002、0.000、0.001、0.000）较空白对照组、感染对照组明显降低，差异均有统计学意义。 结论成功构建的CTGF shRNA慢病毒颗粒可有效抑制视网膜血管内皮细胞迁移并下调内源性CTGF的表达。

高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白对视网膜血管内皮细胞的影响

目的观察高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白（TTR）对人视网膜血管内皮细胞（hREC）的影响。方法分别于5．5mmol／L葡萄糖（低糖，LG）、25．0mmol／L葡萄糖（高糖，HG）以及200μmol／LCoCl2诱导的缺氧环境中培养hREC、人视网膜色素上皮细胞（hRPEC），并据此分为LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组。实时无标记细胞功能分析仪检测细胞培养初始时间（Oh）及培养后4、8、16、24、36、48、60、72h的细胞生长指数。分别在LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组细胞培养基中添加4tLmol／LTTR，即LG组＋TTR、LG缺氧组＋TTR、HG组＋TTR、HG缺氧组＋TTR，观察TTR对hREC和hRPEC的作用以及hRPEC对hREc生长的影响。Transwell共培养体系观察hPEPC对hREC生长影响。结果培养后72h，LG组hREc、hRPEC生长指数明显高于LG缺氧组、HG组，差异均有统计学意义（hREC：F=17．098、22．970，P〈0．05；hRPEC：F=45．442、9．011，P〈0．05）；HG组、HG缺氧组hREC、hRPEC生长指数显著降低，差异均有统计学意义（hREC：F=146．184，P〈0．05；hRPEC：F=27．907，P〈0．05）。HG组＋TTR、HG缺氧组＋TTRhREC生长指数显著低于HG组、HG缺氧组，两组hREC生长指数比较，差异有统计学意义（F=161．430、24．106，P〈0．05）；LG组＋TTR、LG缺氧组＋TTRhREC生长指数高于LG组，LG缺氧组，两组hREC生长指数比较，差异有统计学意义（F=200．486、48．662，P〈0．05）。LG组＋TTR、LG缺氧组＋TTR、HG组＋TTR、HG缺氧组＋TTRhRPEC生长指数均较LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组略高，但差异无统计学意义（P〉0．05）。共培养与单独生长细胞相比，共培养hRPEC对hREC生长有显著抑制作用，差异有统计学意义（LG组：F=15．711，P〈0．05；LG缺氧组：F=45．659，P〈0．05；HG组：F=7．857，P〈0．05；HG缺氧组：F=6．348，P〈0．05）。绪论高糖缺氧环境下TTR对hREC生长有抑制作用。

P2X7受体与视网膜神经元细胞死亡相关性研究现状与进展

视网膜神经元细胞是视觉形成的重要参与者。由于再生能力差，当神经元细胞发生损伤或死亡时，往往会导致视功能不可逆转的损害。P2X7受体是一种三磷酸腺苷（ATP）门控的阳离子通道受体。近期研究发现，P2X7受体在视网膜神经元细胞的变性死亡中发挥着重要的作用。在一系列动物模型中，暴露于缺血缺氧、高眼压、机械创伤等环境或加入外源性受体激动剂的情况下，胞外升高的ATP可活化神经元细胞表面的P2X7受体。而经活化的受体可经直接或间接途径引起神经节细胞、光感受器细胞等视网膜神经元细胞的死亡，通过受体特异性的拮抗剂及基因敲除技术下调P2X7受体的表达及功能后，神经元细胞的丢失得到了明显的改善。P2X7受体有可能成为与神经元细胞损伤相关的视网膜疾病的一个新的治疗靶点。

逆转录病毒感染法对RP患者人体细胞向iPS细胞和iPS—RPE细胞诱导分化的研究

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性（RP）的主要手段。诱导多能干细胞（iPSCs）将成为移植细胞的一个重要来源，人胚胎干细胞（hESCs）可以无限期地自我更新和分化，是RPE细胞移植的重要供体来源。此外，iPS-RPE细胞为患者自身细胞成为治疗源组织提供了个性化治疗平台。目的评估利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c—Myc和K归4种基因导入RP患者皮肤成纤维细胞后诱导入iPSCs的可行性，并建立将正常人iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法。方法分别采集基因突变点为SNRNP200p．S1087L的RP患者及无SNRNP200p．S1087L突变受试者的大腿皮肤组织块约2cm-3cm。采用胰蛋白酶消化和组织块培养法分离纯化得到成纤维细胞并进行传代，取第3代细胞用于研究，分别采用形态学和免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定。采用含OCT4、SOX2、C—MYC和KLF44种cDNA的质粒病毒转染的成纤维细胞，并用hESCs条件培养液诱导iPSCs，采用细胞形态学、碱性磷酸酶（AP）染色、干细胞表面多潜能标志物表达对所得到的iPSCs和iPS—RPE细胞进行鉴定，并通过细胞在SCID小鼠的体内种植考察iPSCs的成瘤性。采用诱导分化拟胚体（EB）法将不含SNRNP200p．S1087L突变的iPSCs诱导分化为RPE细胞，分别采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR法检测细胞中特异性蛋白的表达。结果用皮肤组织块培养的成纤维细胞呈梭形和多角形，光学显微镜下可见细胞间排列紧密，细胞形态和大小趋于一致，细胞中特异性蛋白Vimentin表达阳性。经逆病毒转染的成纤维细胞培养后第5～7天可见小的细胞聚集，细胞形态由梭形变为圆形；培养后20d出现类似hESCs集落形态的iPSCs克隆；培养后25～30d细胞中的标志物SSEA3、SSEA4、TRA—1-60、TRA-1-81及Nanog均呈阳性表达，培养后12周形成的iPSCs克隆中AP染色阳性，接种到SCID小鼠体内后形成畸胎瘤。免疫荧光染色显示，诱导分化后30d时iPS—RPE细胞中RPE细胞特异性标志物RPE65、闭锁小带蛋白1（ZO-1）和卵磷脂视黄醇酰基转移酶（LRAT）蛋白均呈阳性表达。结论利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Kif44种基因转入SNRNP200p.S1087L突变的RP患者皮肤成纤维细胞后可以获得iPSCs，建立的iPSCs有ESCs的形态和多能分化的特征。采用同样的转染技术可在无SNRNP200p．S1087L突变的人皮肤成纤维细胞中建立体外高分化、高效能的iPS-RPE细胞。

视网膜下腔注射视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响

目的观察视网膜下腔注射视网膜色素上皮（RPE）细胞对小鼠RPE层的影响。方法采用随机数字表法将30只7日龄C57BL／6J新生小鼠分成正常组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组及OIR模型细胞移植组，每组10只小鼠。OIR模型组及OIR模型细胞移植组建立OIR模型。OIR模型细胞移植组小鼠建模后经外路视网膜下腔移植RPE细胞。注射20d后，脊髓脱臼法处死各组小鼠并摘除双眼眼球。行视网膜冰冻切片，荧光显微镜下观察小鼠RPE层厚度变化；采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测小鼠RPE层RPE65、斑萎蛋白（Bestrophin）、紧密连接蛋白（ZO）-1的蛋白相对表达量；采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测小鼠RPE层RPE65、Bestrophin、ZO-1的mRNA相对表达量。结果荧光显微镜观察发现，OIR模型组小鼠RPE层较正常组明显变薄，OIR模型细胞移植组小鼠RPE层较OIR模型组明显增厚。Westernblot检测结果显示，OIR模型组、OIR模型细胞移植组小鼠RPE层RPE65、Bestrophin、ZO-1蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=8．597、18．864、25．69i，P〈0．05）。RT—PCR检测结果显示，OIR模型组、OIR模型细胞移植组小鼠RPE层RPE65、Bestrophin、ZO-1mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=39．458、11．461、34．796，P〈0．05）。结论视网膜下腔注射RPE细胞可促进小鼠RPE层增厚；RPE65、Bestrophin蛋白相对表达量增加，ZO-1蛋白相对表达量降低；RPE65、Bestrophin、Z（YlmRNA相对表达量增高。

聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子高表达对糖基化终末产物诱导下人视网膜微血管内皮细胞氧化损伤的作用

目的观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下人视网微血管内皮细胞(hRMECs)氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉(ZnPP)组及PSF+ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基,置于37°C、95%空气、5%CO2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP(10 mol/L)处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后,再用ZnPP(10 mol/L)预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激,HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)、磷酸化(p)细胞外调节蛋白激酶(ERK)、核因子2相关因子2(Nrf2)的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126,Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。结果HE染色和Hoechst33258染色结果显示,PSF组受损细胞核数较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异均有统计学意义(F=27.5、38.7,P<0.05)。流式细胞法结果显示,PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异有统计学意义(F=126.4,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加,差异均有统计学意义(F=70.1,P<0.05);AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较,差异均有统计学意义(F=474.0,P<0.05);PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加,PSF+/U0126+组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低,差异有统计学意义(F=30.2、489.4,P<0.05)。结论PSF高表达可以通过活化ERK通路,促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达,从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。