糖尿病通过下调GPX4引起视网膜光感受器细胞的损伤及其机制

目的探讨糖尿病视网膜光感受器中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达变化,及其与视网膜光感受器细胞损伤的有关机制。方法收集2018—2021年武汉市红十字会同济医院遗体(器官)捐献登记及眼角膜接收站8名年龄匹配男性遗体捐献者眼后段组织,其中非糖尿病捐献者和糖尿病捐献者各4名,分别作为对照组和糖尿病组。选取健康SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠14只,采用随机数表法将小鼠随机分为糖尿病组和对照组,每组7只,其中糖尿病组小鼠按照50 mg/kg剂量腹腔内注射链脲佐菌素,连续5 d,对照组不做特殊处理。将小鼠光感受器细胞661W分为晚期糖基化终末产物(AGEs)组和对照组,其中AGEs组采用100μg/ml AGEs处理24 h模拟糖尿病损伤,对照组不做特殊处理。采用苏木精-伊红染色法观察各组人及小鼠视网膜光感受器细胞外节形态;采用免疫荧光染色法观察人及小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、视紫红质(Rhodopsin)和GPX4表达;采用Western blot法检测小鼠视网膜中GFAP、Rhodopsin和GPX4的表达及661W细胞中GPX4的表达;采用细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组661W细胞活力;采用TBA法检测小鼠视网膜及细胞中丙二醛(MDA)浓度;采用羟胺法检测小鼠视网膜及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果苏木精-伊红染色结果显示,与对照组比较,糖尿病组人和小鼠视网膜光感受器细胞外节变形或断裂。GFAP荧光信号主要出现在人和小鼠内层视网膜,着染细胞为梭形或多角形,与胶质细胞形状吻合,糖尿病组视网膜中GFAP荧光信号较对照组增强。Rhodopsin仅在光感受器细胞外节层表达,边界清晰,GPX4在全视网膜均有表达,光感受器细胞外节层信号较强;糖尿病组Rhodopsin和GPX4荧光信号较对照组减弱。糖尿病组人和小鼠GFAP相对表达量均明显高于对照组,Rhodopsin和GPX4相对表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。AGEs组细胞活力值明显低于对照组,差异有统计学意义(t=13.490,P<0.001)。AGEs组GPX4蛋白相对表达量为0.42±0.12,明显低于对照组的1.00±0.04,差异有统计学意义(t=9.041,P<0.001)。糖尿病组小鼠视网膜组织和AGEs组细胞中MDA浓度高于对照组,SOD活性值低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论糖尿病能降低视网膜光感受器细胞中GPX4水平,引起氧化-抗氧化系统失衡,可能是糖尿病引起视网膜光感受器细胞损伤的机制。

间充质干细胞来源外泌体对视网膜光感受器细胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平作用的研究

目的 探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)下外泌体对视网膜光感受器细胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平的影响。方法 应用免疫印迹检测人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)外泌体表面标志蛋白CD63及CD90,应用流式细胞仪检测光损伤661W细胞凋亡,应用免疫荧光检测Ang-1,应用免疫印迹检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果 形态学及免疫印迹检测CD63、CD90表达结果证实h UCMSCs外泌体。线粒体膜电位检测结果以及细胞形态学鉴定661W细胞建立光损伤模型成功。流式细胞仪、免疫荧光检测结果显示,与正常组比较模型组细胞凋亡率及Ang-1阳性表达增加,在经过h UCMSCs干预后有所降低,且呈现出明显的浓度依赖性(P<0.05)。免疫印迹结果显示,与正常组比较,模型组PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达降低,经过h UCMSCs干预后有所升高(P<0.05),且高浓度组PI3K、AKT、pPI3K、p-AKT表达水平与激动剂组比较无差异(P>0.05),模型组PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达水平高于抑制剂组(P<0.05)。结论 间充质干细胞下外泌体可能是通过激活PI3K/AKT通路,抑制了视网膜光感受器细胞的凋亡以及Ang-1的水平,从而对光损伤视网膜起保护作用。

牛膝多肽对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)介导的视网膜光感受器细胞损伤的保护作用

目的探讨牛膝多肽(ABPP)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)介导的光感受器细胞损伤的保护作用,并初步探讨ABPP保护作用的可能机制。方法在培养的光感受器细胞RGC-5中加入不同浓度的ABPP(0.05 mg·L^(-1)、0.10 mg·L^(-1)、0.50 mg·L^(-1)、1.00 mg·L^(-1)、5.00 mg·L^(-1))作用10 h后,通过NMDA(0.1 mmol·L^(-1))介导细胞损伤,同时设立NMDA组、正常组和地卓西平(MK-801)组。倒显微镜下观察各组细胞形态变化;MTT法检测细胞生存率;利用Hoechst 33258/PI双染和流式细胞仪测定细胞凋亡;钙离子成像观察细胞内钙离子变化;实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的变化。结果NMDA组RGC-5细胞生存率较正常组明显下降(P<0.01);与NMDA组比较,0.10 mg·L^(-1)ABPP组、0.50 mg·L^(-1) ABPP组和1.00 mg·L^(-1) ABPP组RGC-5细胞生存率升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);MK-801组细胞生存率也明显高于NMDA组(P<0.05),与0.50 mg·L^(-1)ABPP组比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此,在后续的实验中选择0.50 mg·L^(-1)为ABPP组的有效药物浓度。正常组、ABPP组、MK-801组细胞凋亡率与NMDA组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ABPP组、MK-801组细胞内钙离子荧光强度与NMDA组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示,与NMDA组比较,正常组、ABPP组、MK-801组细胞内Bcl-2 mRNA表达均增加,Bax mRNA表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论ABPP可抑制NMDA介导的视网膜光感受器细胞损伤,作用呈一定的浓度依赖性,其机制可能与抑制钙内流以及上调Bcl-2 mRNA表达、下调Bax mRNA的表达有关。

枸杞多糖对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的视网膜光感受器细胞损伤的保护作用

目的探讨枸杞多糖(LBP)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜光感受器细胞损伤的保护作用,及其可能的作用机制。方法实验分为正常组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组。低、中、高剂量实验组分别给予0.01、0.50、2.00 mg·mL^(-1) LBP;对照组给予10μmol·L^(-1) MK-801溶液;正常组和模型组均给予等体积的完全培养基。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法观察细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用钙成像观察胞内钙离子浓度,用蛋白质印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。结果中剂量实验组、对照组、模型组和正常组的细胞存活率分别为(85.92±6.21)%、(72.33±5.45)%、(37.92±2.31)%和(97.12±5.11)%,凋亡率分别为(13.80±0.52)%、(15.22±0.51)%、(38.10±0.67)%和(5.34±0.46)%,加入NMDA后30 s钙离子相对浓度分别为3.00±0.37、4.65±0.24、27.24±0.96和1.02±0.32,Bcl-2蛋白相对表达水平分别为0.80±0.05、0.78±0.02、0.30±0.04和1.00±0.05,Bax蛋白相对表达水平分别为1.57±0.04、1.91±0.05、5.18±0.06和1.00±0.04。中剂量实验组和对照组的上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论LBP可减缓NMDA对视网膜光感受器细胞的损伤,其作用机制可能与抑制钙离子内流及下调Bax表达、上调Bcl-2表达有关。

磷酸二酯酶6与视网膜病变

磷酸二酯酶6(PDE6)是对环鸟苷酸(cGMP)特异的PDE,广泛分布于视网膜杆状光感受器细胞中,是脊椎动物光转录过程中的关键酶。它通过调节细胞内特定区域的cGMP水平,参与脊椎动物视觉传导级联反应。PDE蛋白质亚基的结构域通过与转导蛋白的直接作用来调节PDE的活性,从而调节光子的转导过程。视网膜色素变性(RP)等疾病的发生与PDE蛋白质亚基的突变密切相关。近年来PDE同工酶在细胞中的定位及定量研究为选择性调节药物的开发提供了研究基础。就PDE6的结构、功能、视功能调控机制及应用前景进行综述。

糖尿病性黄斑水肿光感受器细胞层与视力的相关研究

目的采用光学相干断层扫描（OCT）技术观察糖尿病性黄斑水肿（DME）患者黄斑区视网膜光感受器细胞层IS／OS连接变化，并分析IS／OS连接变化与视力的关系。方法回顾性病例研究。选取2014年7月至2015年12月秦皇岛市海港医院确诊为DME患者155例（310只眼），应用OCT检查，观察患者黄斑中心凹视网膜厚度及黄斑区IS／OS连接变化；采用SPSS19．0软件对观察结果进行分析。结果DME患者黄斑中心凹视网膜厚度与IS／OS连接缺损长度之间差异有统计学意义（r=0．901，P=0．000），黄斑中心凹视网膜厚度与最佳矫正视力之间差异有统计学意义（r=-0．629，P=0．000），IS／OS连接缺损长度与最佳矫正视力之间差异有统计学意义（r=-0．729，P=0．000）。IS／OS缺损长度任意两组之间的患眼视力及黄斑中心凹视网膜厚度均有统计学意义（P〈0．05）。结论DME患者黄斑区IS／OS连接改变和最佳矫正视力有一定的关系，对判断患者的视力、预后及病情随访有一定的指导意义。

黄斑裂孔内界膜撕除术后视网膜内层远期形态改变的影像学观察

目的探讨黄斑裂孔内界膜撕除术后视网膜内层远期的形态学改变特点。方法回顾性病例研究。收集2015至2018年间诊断为特发性黄斑裂孔、于北京中日友好医院行25G玻璃体切除+内界膜撕除(或反折)+长效气体填充术的患者。共纳入特发性黄斑裂孔术后患者17例(19只眼),其中男性4例(4只眼),女性13例(15只眼);年龄(62.7±5.2)岁。通过相干光层析成像术(OCT)获得患者黄斑区视网膜厚度地形图、黄斑区神经节细胞复合体(mGCC)地形图及病损概率图、黄斑区视网膜血管扫描及en-face扫描结果。综合分析术后视网膜内层形态学改变的影像学特点。结果19只眼中,内界膜撕除者9只眼,内界膜荷包样反折8只眼,上方180°内界膜反折2只眼。黄斑裂孔最小径为(543.06±220.17)μm,最大径为(947.18±319.12)μm;患者随访时间为(21.05±9.66)个月,末次随访视力0.45±0.35。19只特发性黄斑裂孔患眼中,所有患眼的黄斑裂孔均于术后闭合,且所有患眼均出现了神经纤维层松解样外观(DONFL)、同轴黄斑区暗斑(CMDS)及mGCC变薄改变。其中行内界膜上方180°反折的2只眼CMDS与mGCC改变主要见于视网膜上方,余17只眼为黄斑周围弥漫性病变,大致与内界膜撕除范围对应。2只眼在视网膜血管扫描结果上可清晰见到视网膜毛细血管密度降低。结论黄斑裂孔内界膜撕除术后视网膜内层远期形态改变显著,可见DONFL和CMDS样改变,改变累及mGCC。

外层视网膜管状结构的研究进展

外层视网膜管状结构(ORT)是指在频域相干光层析成像术(SD-OCT)中观察到的位于视网膜外核层的圆形或类圆形、边缘高反射信号而内腔相对低反射信号的异常结构,伴有局部视网膜外界膜中断、卷曲及视网膜色素上皮萎缩。组织病理学研究认为ORT是光感受器细胞和外层视网膜在病理条件下发生的重构,是外层视网膜严重损伤的表现。ORT可见于多种视网膜退行性疾病的终末阶段,在年龄相关性黄斑变性中较为常见,且随着随访时间的延长逐渐增多。ORT在SD-OCT中的形态与视网膜内积液或囊样水肿有一定相似之处,但其并不是新生血管活动和再治疗的依据,且对抗血管内皮生长因子治疗反应不佳,视力预后较差。因此充分认识ORT,对临床开展相关眼底病治疗、判断预后十分重要。本文对目前有关ORT的组织病理学研究及临床研究的进展进行总结,以期为临床工作提供参考。