人视网膜前体细胞的体外视网膜组织片下移植

目的研究人视网膜前体细胞移植到体外培养的人视网膜组织片下的细胞分化。方法取无眼部发育异常的4～5个月胚胎眼球，进行视网膜前体细胞分离培养。将传代的细胞移植到体外培养的视网膜神经上皮组织片下，通过光学显微镜和免疫组织化学观察细胞分化和组织整合情况。结果人视网膜前体细胞在体外培养时形成神经球样细胞团，传代后形成子代细胞团，表达神经干细胞标志Nestin。体外培养的视网膜组织片在5d、10d均能基本维持视网膜结构。移植到视网膜组织片下的视网膜前体细胞能够与其建立细胞连接。这些视网膜前体细胞分化后能够表达胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白-2和视紫红质，分别为神经胶质细胞、神经元和光感受器细胞的特异蛋白。结论人视网膜前体细胞具有神经干细胞特征，在体外移植到培养的人视网膜组织片下，能够分化成相应的终末分化细胞。

胚胎干细胞源性视网膜前体细胞在rd鼠视网膜下腔移植后的分化

目的研究绿色荧光蛋白标记的胚胎干细胞(green fluorescent protein-embryonic stem cells,GFP-ESC)源性视网膜前体细胞在rd小鼠视网膜下腔移植后的存活分化情况。方法将GFP-ESC源性视网膜前体细胞移植到伴有视网膜感光细胞变性和继发性视网膜神经节细胞变性的rd小鼠视网膜下腔,移植后1周、4周、8周取材行免疫荧光细胞化学检测,观察移植细胞存活、分化情况。对移植细胞进行核型分析,并接种裸鼠眼内观察是否成瘤,评价其安全性。结果GFP-ESC源性视网膜前体细胞移植眼内可存活、整合到宿主变性视网膜层间。1周时GFP阳性细胞移行于外层视网膜并呈视杆细胞标志抗原rhodop-sin阳性;4周时整合于内层视网膜,共表达成熟神经元标志抗原神经丝蛋白-200、微管相关蛋白-2,突触标志抗原synaptophysin检测阳性;8周时移至邻近玻璃体腔形成节细胞样结构,表达节细胞标志抗原Thy1.1;移植细胞维持正常二倍体核型,术后8周未见排斥反应及瘤性增殖。结论GFP-ESC源性视网膜前体细胞在变性视网膜中可存活、整合,并有优先向变性的感光细胞及神经节细胞类型分化的倾向,有望为青光眼等视神经视网膜病变的细胞移植治疗提供安全有效的种子细胞。

视网膜前体细胞移植对缺血再灌注损伤大鼠视网膜形态影响的实验研究

目的:研究视网膜前体细胞(RPCs)移植对视网膜缺血再灌注(RIR)损伤大鼠视网膜形态的影响。方法:选取成年健康雄性SD大鼠56只,随机分为七组,每组8只。对照组不做任何处理;假手术组(sham组)只做前房穿刺;视网膜缺血再灌注损伤组(RIR组)为前房灌注模型组;视网膜前体细胞视网膜下腔移植组(RIR+R-C组)前房灌注后在视网膜下腔移植RPCs;磷酸盐缓冲液(PBS)视网膜下腔移植组(RIR+R-PBS组)前房灌注后在视网膜下腔移植PBS;视网膜前体细胞上丘移植组(RIR+SC-C组)前房灌注后在上丘移植RPCs;PBS上丘移植组(RIR+SC-PBS组)前房灌注后在上丘移植PBS。通过免疫荧光染色观察移植细胞在大鼠体内存活、迁徙与分化情况,并比较各组视网膜厚度。结果:移植的RPCs能够在大鼠体内存活至少8周。上丘移植的RPCs未发现迁移到视网膜,视网膜下腔移植的RPCs能够迁移到视网膜外核层并表达视杆细胞标志物视紫红质。RPCs移植后8周,RIR+SC-C组视网膜厚度与RIR+SC-PBS组比较显著增加(P<0.001);RIR+R-C组视网膜厚度与RIR+R-PBS组比较显著增加(P<0.001);RIR+R-C组视网膜厚度与RIR+SC-C组比较显著增加(P<0.001)。结论:视网膜前体细胞移植能够改善视网膜缺血再灌注损伤大鼠视网膜变薄的情况。

低氧诱导趋化因子受体表达对视网膜前体细胞迁移能力的影响

背景体外研究表明，趋化性细胞因子受体4（CXCR4）及其配体基质细胞衍生因子-1（SDF．1）在诱导视网膜前体细胞（RPCs）定向迁移的过程中可能起重要作用。RPCs表达CXCR4升高能增强干细胞的趋化活性，从而提高移植细胞的定向迁移能力。目的探讨RPCs在低氧条件下CXCR4受体的表达。方法分离孕龄17d的NIH小鼠的胚胎视网膜细胞并制备成含5×10^6～10×10^6个／L细胞的悬液，将细胞接种到25cm2培养瓶中，用全神经球贴壁培养法进行培养。RPCs在正常O2（体积分数16％O2）和低O2（体积分数10％O2）环境中培养12h和24h后，用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测CXCR4和缺氧诱导因子-1（HIF-1）mRNA的表达；流式细胞仪（FACS）检测RPCs中CXCR4阳性细胞的百分比；Boyden小室实验观察30μg／L的SDF-1对RPCs的趋化效应。结果10％O2培养12h和24h后，RPCs中CXCR4mRNA的表达量（CXCR4mRNA／B—actinmRNA）分别为0．28±0．07和0．48±0．17，比正常氧培养组的0．16±0．02升高了1．75倍和3．00倍，10％O2培养12h和24h后RPCs中HIF-1mRNA表达量（HIF—1mRNA／B—actinmRNA）分别为0．18±0．07和0．38±0．13，比正常氧培养组的0．06±0．01升高了3．00倍和6．30倍，差异有统计学意义（P〈0．01）。Boyden小室实验表明，10％O2培养12h和24h后SDF-1对RPCs的趋化效应由正常氧的13．00％分别上升到36．00％和46．00％。FACS检测表明，10％O2诱导12h和24h后，RPCs中CXCR4阳性细胞率由正常氧浓度的9．01％分别上升到26．90％和46．10％，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论RPCs在低氧条件下CXCR4受体表达增加，同时对SDF-1的趋化能力增强。HIF-1的表达增加是CXCR4表达增高的可能机制。

条件培养液对人视网膜前体细胞分化的诱导

目的：研究各种培养液对人视网膜前体细胞（RPC）的诱导分化作用。方法：分离培养3～5个月人胚胎RPC，分别用胎牛血清（FBS组）、视网膜组织培养上清（RE组）、视网膜色素上皮培养上清（RPE组）诱导分化。采用免疫组化SP法检测细胞诱导前后Nestin、微管相关蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、视紫红质（Rhodopsin）及蛋白激酶C（PKC）和钙结合蛋白（Calbindin）的表达情况，流式细胞术检测诱导后MAP-2、GFAP及Rhodopsin阳性细胞数。结果：原代及传代培养的RPC表达Nestin，能分裂增殖，形成子代细胞团。RE组和FBS组细胞诱导分化后形态多样，连接广泛；RPE组细胞呈圆形，不贴壁。诱导分化后RE组细胞MAP-2的表达高于RPE组和FBS组（P〈0．01）．而Rhodopsin的表达低于RPE组（P〈0．01）；GFAP的表达在RPE组最低，RE组较高，FBS组最高（P〈0．05）。结论：不同培养基诱导呵使人RPC的分化产生差异。

人视网膜星形胶质细胞发育及与血管前体细胞的关系

目的：研究人视网膜星形胶质细胞的发育及与血管前体细胞的关系。材料和方法：收集１３４例发育各期胎儿视网膜和４例成人视网膜，石蜡包埋切片和整装铺片，四种抗体免疫组化染色，光镜观察。结果：星形胶质细胞分为三种：①Ｓ－１００（＋）／胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）（＋）的双极形星形胶质细胞，于１３周经视盘进入视网膜，与跟随其后的纤连蛋白（Ｆｎ）（＋）的血管前体细胞接触并相伴向锯齿缘迁移。足月后和成人此类星形胶质细胞主要位于节细胞层，突起包裹节细胞层和神经纤维层中的血管及神经纤维束。②Ｓ－１００（－）／ＧＦＡＰ（＋）双极形星形胶质细胞和③星状星形胶质细胞。后两类细胞晚于血管前体细胞进入视网膜，与后者无伴行关系。足月后和成人，细胞体分布于节细胞层，突起包裹节细胞层和内核层内、外缘的血管。结论：人视网膜内存在形态学和免疫学特点不同的三种星形胶质细胞。其中 Ｓ－１００（＋）／ＧＦＡＰ（＋）的星形胶质细胞可能参与了血管发生。

Notch信号对视网膜前体细胞分化的作用

目的:观察Notch信号对体外培养的SD大鼠视网膜前体细胞分化的影响。方法:从胎龄16d的SD大鼠分离视网膜神经上皮,采用悬浮法培养视网膜前体细胞。实验分Notch信号抑制组和对照组两组。第14天行免疫细胞化学法分析细胞类型、Notch信号的表达及变化。结果:视网膜前体细胞大部分表达Notch1胞内段及其下游转录因子Hes1,少量细胞表达bHLH转录因子NeuroD和Mash1;自发分化后大量细胞表达bHLH转录因子NeuroD和Mash1,少量细胞表达Notch1胞内段和Hes1。Notch信号抑制组Nestin,GFAP阳性率显著低于对照组,β-tubulin阳性率显著高于对照组,而Recoverin阳性率与对照组差异无统计学意义。结论:Notch1信号在体外可能参与了对视网膜前体细胞分化的抑制,抑制Notch信号可部分促进视网膜前体细胞向神经元分化,同时抑制了神经胶质细胞的分化。

Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用。方法分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数。结果视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞。不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同。单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%。相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义。相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义。结论Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。

成人视网膜前体细胞的体外分离培养和鉴定

【目的】对成人视网膜前体细胞进行体外分离、培养和鉴定。【方法】成人眼球12只,“机械分离联合酶消化法”分离出睫状上皮层的色素性细胞,10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+10ng/mL表皮生长因子(EGF)的无血清DMEM/F12培养液中培养,并从三方面鉴定其神经干细胞特性:A.免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白Nestin的表达;B.自我更新能力:原代神经球消化传代后,继续培养观察新神经球的形成;C.多向分化潜能:原代细胞培养4～5d,改用含10mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液,继续培养7～10d,分别用抗神经丝蛋白(NF)抗体、抗微管相关蛋白-2(MAP2)抗体、抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、抗视紫质蛋白抗体、抗β-微管蛋白抗体以及抗无长突细胞特异性抗体作免疫荧光细胞染色。【结果】0.48%±0.08%(1∶208)原代细胞在含bFGF+EGF无血清培养条件下能保持增殖未分化状态,形成神经球样结构,消化传代后90.1%±8.3%的第二代细胞能重新形成新的神经球样结构,具有自我更新能力;原代及传代后的神经球均表达神经干细胞特异性抗原nestin;在含10mL/L胎牛血清的促分化培养液中,细胞分别分化为可表达神经细胞、星形神经胶质细胞和感光细胞等特异性抗原的细胞,表明具有多向分化潜能。【结论】在成人眼睫状体扁平部分离得到具有干细胞特性的视网膜前体细胞,并在体外成功进行培养鉴定。

人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化特性

背景：视网膜干细胞已在多种脊椎动物眼内发现，但目前对人类视网膜干细胞或前体细胞的生物学特性尚知之甚少。目的：探讨人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化潜能。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-03／2006-02在中山大学中山眼科中心完成。材料：人胚胎神经视网膜来源于4例流产胎儿。方法：分离胚胎眼球神经视网膜，经胰酶消化法制备单细胞悬液，加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、左旋谷氨酰胺的无血清高糖DMEM／F12培养基进行原代及传代培养。收集培养第1～3代的细胞克隆球体，接种到右旋多聚赖氨酸及层粘连蛋白预包被的6孔细胞培养板内，培养7d后行免疫细胞化学染色。主要观察指标：倒置显微镜下观察视网膜前体细胞分化前后的形态变化，免疫细胞化学法鉴定分化细胞特性。结果：部分人胚胎神经视网膜细胞呈神经球体样悬浮生长，细胞球体边界清楚，折光性强，表达视网膜前体细胞标签巢蛋白；将其接种到分化条件下培养7d后，细胞体积增大，变扁平，呈梭形、多角形，伸出大小不等的细胞突起，大部分细胞表达视网膜神经元细胞分子标签βⅢtubulin和胶质细胞标签胶质纤维酸性蛋白，少量细胞表达光感受器标签视紫红质。结论：人胚胎视网膜前体细胞可在体外扩增培养，在胎牛血清联合右旋多聚赖氨酸、层粘连蛋白特定诱导条件下，可以向视网膜神经元、胶质细胞及光感受器细胞分化。

大鼠视网膜前体细胞的传代培养及体外分化诱导

目的了解表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及睫状神经营养因子(CNTF)对其分化的影响。方法取孕18d的SD大鼠胚胎眼的视网膜,分别用悬浮法及贴壁法培养。传至第一代后转入分别含10ng/mlCNTF、20ng/mlEGF、10ng/mlbFGF、10%胎牛血清的DMEMF12中进行诱导分化,贴壁后2、3、4、6d分别行nestin、Vimentin、Opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色。结果大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长,nestin及Vimentin染色阳性,悬浮培养传至一代,贴壁培养传至五代,传代后细胞数量不断减少并可在体外分化为含视网膜光感受器细胞及胶质细胞的混合神经元。CNTF、bFGF及EGF不同程度地增加了光感受器细胞的比例。结论RPCs可在体外培养并传代。CNTF、bFGF及EGF参与视网膜发育的调节。

新生小鼠视网膜光感受器前体细胞的体外培养及鉴定

目的对新生小鼠视网膜光感受器前体细胞进行分离和鉴定。方法同窝新生小鼠14只,随机分为7组(P1-P7),每组2只,出生后连续7d每天取1组幼鼠,分离视网膜并进行体外培养,观察其生长状况。传代后培养2周,然后采用细胞荧光免疫组化法检测细胞中的5-溴-2′脱氧尿嘧啶(BrdU)、细胞神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、神经视网膜亮氨酸拉链(Nrl)和视蛋白(Opsin)的表达情况,并对视网膜光感受器前体细胞性质进行分析。结果在特定的培养基中,部分P1-P7各组新生小鼠视网膜细胞贴壁生长,荧光免疫组化标记显示传代后生长细胞大部分为BrdU阳性细胞。P1-P7组Nestin阳性率分别为31.0%、31.6%、32.3%、30.2%、31.2%、30.9%、29.5%。Nrl阳性细胞数出生后3d开始明显增多,随后小幅增加,P1-P7组阳性率分别20.6%、35.2%、65.5%、68.6%、71.6%、73.0%、73.3%。P1-P4组细胞不表达Opsin,P5-P7组少量细胞表达Opsin。结论新生小鼠视网膜存在视网膜光感受器前体细胞,该细胞具有分裂增殖能力及向视网膜光感受器细胞分化和表达视蛋白的潜能,并于生后3d明显增多,此后逐渐分化为成熟的光感受器细胞。

不同时期视网膜前体细胞的培养

目的研究不同时期视网膜前体细胞的培养。方法分离E14和E18 SD大鼠的视网膜前体细胞,用改进DMEM/F12无血清培养基悬浮培养并利用体外诱导分化、免疫细胞化学、扫描电镜和透射电镜等方法对细胞进行鉴定。结果视网膜前体细胞在DMEM/F12无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化。扫描电镜可见细胞球和分化细胞的形态,透射电镜可见细胞球和分化细胞的超微结构。免疫细胞化学显示,悬浮培养的细胞球中大部分细胞表达神经外胚层源性干细胞标志物nestin和细胞分裂增殖标志物BrdU。贴壁后,视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括Thy1.1阳性的视网膜神经节细胞。E14和E18视网膜神经节细胞的百分比分别为16.91%±4.05%和4.65%±1.88%,两组比较,差异有统计学意义(t=15.04,P<0.001)。结论改进DMEM/F12无血清培养基可成功培养视网膜前体细胞,培养的细胞具有无限增殖和多向分化潜能。早期视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较高。

全神经球贴壁培养法体外长期扩增视网膜前体细胞

目的:探寻一种既高效又能连续体外扩增视网膜前体细胞(RetinalProgenitorCell,RPC)的培养方法。方法:小鼠胚胎视网膜细胞采取神经球贴壁培养或直接贴壁培养法。神经球贴壁培养时,先经悬浮培养生成富含前体细胞的神经球,然后将低速离心分离出的神经球接种到Poly-D-Lysine包被的培养瓶,在前体细胞培养液中(含FGF-2、EGF和LIF)贴壁培养,头24h在培养液中添加10%的胎牛血清。直接贴壁培养法是将细胞悬液直接接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶。免疫组化和FACS分析神经球贴壁培养细胞的干细胞特性和分化能力,并与直接贴壁培养法得到的细胞进行比较。结果:神经球接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶后贴附到培养瓶底,逐渐形成贴壁生长的单层细胞。该法能够在体外长期扩增视网膜前体细胞,3个月内细胞能够传代10次以上。在RA诱导分化时,能够生成成熟视网膜细胞,表达视网膜细胞特异性标记。FACS分析和免疫组化染色显示神经球贴壁培养所得细胞在未分化时Nestin阳性率(92%)细胞率以及分化为成熟视网膜细胞的比率(53.7%),均高于直接贴壁培养法获得的细胞。结论:神经球贴壁培养法能够在体外长期大量扩增视网膜前体细胞,能较好地保持干细胞特性,并容易分化为成熟的视网膜细胞,较直接贴壁培养具有较大的优越性。

人视网膜前体细胞的体外培养、纯化和诱导分化

目的 体外培养和纯化人视网膜前体细胞,研究其分化的诱导因素.方法 培养3～5个月人胚胎视网膜前体细胞,鉴定其神经干细胞特性.流式细胞术比较其传代前后的含量.观察不同培养条件对其分化的诱导.结果 人视网膜前体细胞能分裂增殖,形成原代和子代神经球,表达Nestin,分化后表达神经烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、蛋白激酶C和神经突触素.传代后Nestin表达量[（39.3±18.9）%]显著高于原代[（28.7±17.7）%]（P＜0.05）.视网膜组织片上清液诱导后神经烯醇化酶表达量[（69.3±6.5）%]高于自发分化者[（59.5±7.6）%]（P＜0.05）.视紫红质表达量[（7.5±2.9）%]则低于自发分化者[（13.2±3.2）%]（P＜0.05）.组织共培养后,同一区域内细胞集中向特定细胞分化.结论 体外培养的人视网膜前体细胞能自我纯化,不同诱导形式使其分化发生偏差.

增强型绿色荧光蛋白基因在人胚胎视网膜前体细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染人胚胎视网膜前体细胞的转染效率及瞬时表达情况,建立人胚胎视网膜前体细胞的示踪方法,为视网膜前体细胞移植提供示踪依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过磷酸钙介导法转染人胚胎视网膜前体细胞．应用流式细胞仪检测其转染效率,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况。结果:pEGFP-N1在基因转染24 h细胞转染率为28．98％,48 h为32．45％,72 h为30．40％,对照未转染细胞24 h、48 h分别为2．50％和2．04％:体外观察培养细胞转染24 h已有绿荧光表达,48-72 h细胞荧光强度最强,96 h荧光强度减弱。结论:pEGFP-N1质粒能有效转染人胚胎视网膜前体细胞,其转染效率可达到30％,是人胚胎视网膜前体细胞较为理想的瞬时表达载体和细胞示踪报告分子。

Notch通路参与调控成年小鼠c-kit+视网膜前体细胞分裂和分化修复NMDA视网膜损伤

目的分析成年小鼠视网膜中c-kit+内源性前体细胞的生物学特性及其在N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)视网膜损伤修复中的作用和机制。方法选取4周龄成年C57BL/6J小鼠,采用NMDA诱导视网膜损伤。免疫荧光检测c-kit+视网膜前体细胞(retinal precursor cells,RPCs)与c-kit配体干细胞因子(stem cell factor,SCF)阳性细胞的关系以及NMDA损伤后1、2、4周视网膜中c-kit+RPCs细胞数量及其分裂状态。荧光定量PCR对比NMDA损伤后不同阶段视网膜中Hes1、Hes5、S100b和Pou4f1的表达变化。结果在成年小鼠视网膜内核层存在SCF+Müller细胞,包围在c-kit+RPCs周围。c-kit+RPCs仍可保持低水平的细胞分裂。在NMDA损伤后2周,c-kit+RPCs细胞数量明显升高(P<0.001),处于对称分裂和不对称分裂期的细胞比例也显著升高(P=0.016),伴随c-kit+GAD65/67+细胞/c-kit+细胞比例升高(P<0.001)。在NMDA损伤后2周,Notch通路因子Hes1和Hes5明显上调(P<0.001),S100b和Pou4f1表达也出现升高(P<0.001)。结论NMDA损伤后2周c-kit+RPCs同时存在对称分裂和不对称分裂两种模式,可向GAD65/67+神经元分化,这一过程可能受到Notch通路的调控。

兔胚胎视网膜前体细胞体外培养纯化方法探究

目的探讨新西兰白兔的胚胎视网膜前体细胞的培养、增殖与纯化方法,并对其性质及体外分化进行鉴定。方法来源于19d、20d及26d不同孕龄的兔胚胎,用内路法取出含视网膜前体细胞的组织,采用胰酶/EDTA消化,利用组织中不同类型细胞对消化液不同的反应,去除混入的间质细胞等成分,达到逐步分离纯化胚胎视网膜前体细胞的目的。对分离所得的细胞,利用倒置相差显微镜观察其生长5情况,同时对相关类型细胞行免疫细胞化学染色,以鉴定视网膜前体细胞。结果从兔胚胎视网膜神经部分离出的原代视网膜前体细胞具有明显的生物学特性:所培养细胞可形成悬浮生长的细胞团,刚贴壁的细胞成簇状生长,这些细胞用免疫细胞化学染色神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达呈阳性。经传代几代后细胞生长趋同,细胞生长呈长梭形,逐渐有细胞分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞等,同时Nestin表达下调。结论不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞均具有相同的形态,这种利用酶消化时间的不同能够分离纯化视网膜前体细胞,为将来研究此类细胞的性质及干细胞的相关研究打下良好的细胞生物学基础。

视网膜前体细胞异种移植于猪视网膜形态的整合及细胞化学水平上的分化

目的：研究小鼠的视网膜前体细胞在移植到成年猪视网膜下腔后，细胞的成活，整合以及分化。

CoCl2诱导大鼠视网膜前体细胞表达VEGF的研究

目的:探讨氯化钴(CoCl2)模拟缺氧环境下对大鼠视网膜前体细胞(RPCs)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达及蛋白分泌的影响。方法:全神经球贴壁法分离、培养、鉴定RPCs。应用RT-PCR及ELISA,检测不同浓度CoCl2(0,50,100,150,200μmol/L)干预24h后RPCs中VEGF表达的变化,检测150μmol/LCoCl2作用不同时间(0,12,24,36,48,72h)RPCs中VEGF表达的变化。结果:全神经球贴壁法培养的RPCs高表达神经干细胞特异性标记(Nestin),自然分化后表达视网膜细胞标志性抗原Rhodopsine,MAP-2和GFAP,在缺氧培养时间相同的情况下,VEGF基因的表达随着CoCl2浓度的增加而逐渐增加而后降低,CoCl2为150μmol/L时达到峰值(P≤0.05)。当CoCl2浓度为150μmol/L培养不同时间时,随着缺氧干预时间的延长,VEGF基因的表达亦是逐渐增加而后降低,于36h时达到峰值(P≤0.05),蛋白与基因表达的变化基本一致。结论:全神经球贴壁法培养RPCs能较好地表达其干细胞特性。CoCl2模拟缺氧环境下,缺氧使RPCs中VEGF的分泌增强并具有时间和剂量依赖性。