滋养肝肾、活血化瘀药物对实验性糖尿病大鼠视网膜周细胞的保护作用

滋养肝肾、活血化瘀药物对实验性糖尿病大鼠视网膜周细胞的保护作用廖品正，李瑞荃，谢学军，张发荣（成都中医学院６１００７５）关键词视网膜周细胞，糖尿病性，滋养肝肾，活血化瘀，动物实验糖尿病性视网膜病变是糖尿病最常见和严重的眼部并发症之一，我们观察了滋养肝...

金丝桃苷对高糖诱导视网膜周细胞损伤的保护作用

目的 探讨金丝桃苷对高糖诱导视网膜周细胞(RPCs)损伤的保护作用,并对其可能机制做出初步探索。方法 将RPCs正常培养传代后接种至细胞培养板,按不同处理分为5组:正常葡萄糖(NG)组(葡萄糖5 mmol/L)、高糖(HG)组(葡萄糖20 mmol/L)、甘露醇(MT)组(葡萄糖5 mmol/L、渗透压20 mmol/L)、高糖+低浓度金丝桃苷(HG+L-HY)组(葡萄糖20 mmol/L、金丝桃苷100μg/mL)、高糖+高浓度金丝桃苷(HG+H-HY)组(葡萄糖20 mmol/L、金丝桃苷400μg/mL)。培育相应时间后,CCK-8法检测各组RPCs活性,Annexin V/PI及TUNEL法检测RPCs凋亡率,Real-time PCR及Western Blot法检测RPCs中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、Gasdermin-D蛋白-N(GSDMD-N)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-18(IL-18)mRNA及蛋白表达水平。结果 与NG组比较,HG组RPCs活性降低,凋亡率升高(P<0.01),NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表达升高(P<0.01)。与HG组比较,HG+L-HY及HG+H-HY组RPCs活性升高,凋亡率降低(P<0.01),NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。与HG+L-HY组比较,HG+H-HY组RPCs活性增高,凋亡率降低(P<0.01),NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。结论 金丝桃苷可减轻高糖诱导的RPCs损伤,且该作用随金丝桃苷浓度提高而增强,其机制可能与抑制RPCs焦亡有关。

基于PI3K/AKT信号通路探讨益气养阴活血利水方抑制早期糖尿病视网膜病变大鼠微血管周细胞凋亡的作用机制

目的观察益气养阴活血利水方对早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜微血管周细胞中磷酸肌醇3-激酶蛋白(phosphatidylinositol 3-kiases,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phospho-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT)信号通路相关因子表达的影响,探讨益气养阴活血利水方抑制早期DR视网膜微血管周细胞凋亡的作用机制。方法138只雄性SPF级SD大鼠随机分成空白组(等体积蒸馏水),模型组,羟苯磺酸钙组[150 mg/(kg·d)],益气养阴活血利水方低剂量组[6.2 g/(kg·d)]、中剂量组[12.4 g/(kg·d)]、高剂量组[24.8 g/(kg·d)],每组23只。除空白组外,各组均采用链佐脲菌素腹腔注射并维持10周高血糖状态,诱导早期DR大鼠模型。造模成功后给药4周,取大鼠眼球进行检测。采用HE染色观察视网膜病理变化,采用TUNEL染色检测大鼠视网膜微血管周细胞凋亡,采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测PI3K、AKT、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8,Caspase-8)、胱天蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3)、细胞凋亡死亡激动剂BID蛋白(apoptotic death agonist BID protein,Bid)在视网膜微血管周细胞中的蛋白和mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01),体质量显著降低(P<0.01),视网膜层次结构不清,各层细胞排列疏松,可见大量凋亡细胞,视网膜中PI3K、AKT mRNA表达水平下降(P<0.01),视网膜细胞凋亡数及Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,益气养阴活血利水方中剂量、高剂量组大鼠血糖均降低(P<0.01);羟苯磺酸钙组、益气养阴活血利水方各剂量组大鼠体质量均升高(P<0.01);益气养阴活血利水方各剂量组大鼠视网膜组织层次结构较清楚,细胞排列相对紧密,视网膜微血管周细胞凋亡数下降(P<0.05);益气养阴活血利水方高剂量组大鼠视网膜微血管周细胞中PI3K、AKT蛋白和mRNA表达水平均明显升高(P<0.01),Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid蛋白和mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)。结论益气养阴活血利水方可能通过调控PI3K/AKT信号通路,上调PI3K、AKT,下调Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid的表达,抑制早期DR大鼠视网膜微血管周细胞的凋亡,从而发挥其对早期DR视网膜微血管周细胞凋亡的保护作用。

葛根素、大黄素对糖基化产物引起的牛视网膜微血管周细胞损伤的影响

应用MTT比色测定细胞活性的方法 ,观察药物对AGE形成的影响以及药物对AGE引起的牛视网膜微血管周细胞损伤的影响。结果葛根素及大黄素与BSA共孵后形成的糖基化产物对周细胞的损伤较不给药组有不同程度的减轻作用 ,终浓度为10mM效应最大 ,提示药物可能在孵育时抑制了AGE的形成 ;细胞培养基中直接加入葛根素 (1,10mM )能对AGE引起的周细胞损伤起一定的保护作用。

黄芪提取物对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞的影响

目的:观察中药黄芪提取物对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞(pericyte,PC)的影响。方法:在体外高糖(20mmol/L)培养2d的第3代周细胞中加入不同浓度的黄芪提取物,继续培养2d,用MTT比色法,测定每组的吸光度值(A值),根据A值计算抑制率。另在周细胞中加入0.4g/L黄芪提取物,2d后收集细胞,用流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。结果:黄芪提取物0.0256～10000mg/L浓度组对高糖培养周细胞的增殖有促进作用,其A值与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)。在周细胞以20mmol/L葡萄糖培养48h后,加入400mg/L黄芪提取物组的细胞凋亡百分率低于空白对照组和模型组(12.2%±1.5%vs7.30%±2.0%,18.6%±2.1%P<0.05)。结论:黄芪能抑制周细胞凋亡,提高体外高糖培养视网膜毛细血管周细胞的存活力。

牛视网膜微血管周细胞和内皮细胞的选择性培养

目的 建立视网膜微血管周细胞 (PC)和内皮细胞 (EC)选择性培养的简便方法。方法 采用含 2 0 %胎牛血清 (FBS)的DMEM和在该培养基中加入 5 %贫血小板人血浆 (PPP)及牛视网膜浸出液 (2 0 μl/ml) ,结合原代培养细胞克隆的分离、除杂。结果 获得的PC和EC能连续传代 ,纯净度 >95 %。PC形状不规则 ,无接触性抑制 ,对 3G5和α 肌动蛋白单克隆抗体染色阳性 ,Ⅷ因子抗体染色阴性 ;EC呈鹅卵石状生长 ,有接触性抑制 ,对Ⅷ因子抗体染色阳性 ,3G5和α 肌动蛋白抗体染色阴性。结论 用 2 0 %FBS的DMEM或在该培养液中加入 5 %PPP及视网膜浸出液 ,结合原代细胞克隆的分离、除杂 。

高糖诱导大鼠视网膜微血管周细胞Ang-2/Tie-2系统表达改变及牛磺酸的防护效应研究

目的通过检测牛磺酸对高糖培养大鼠视网膜微血管周细胞(retinal microvascular pericytes,RMPs)中血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)/Tie-2系统表达的影响,探讨其防护糖尿病视损伤的机制。方法高糖培养大鼠RMPs,实验分正常对照组(Con,5mM D-glucose)、低剂量牛磺酸对照组(Con+0.1mM Tau)、中剂量牛磺酸对照组(Con+1mM Tau)、高剂量牛磺酸对照组(Con+10mM Tau)、甘露醇渗透对照组(Con+mannitol)、高糖组(HG,25mM D-glucose)、低剂量牛磺酸干预高糖组(HG+0.1mM Tau)、中剂量牛磺酸干预高糖组(HG+1mM Tau)、高剂量牛磺酸干预高糖组(HG+10mM Tau)、甘露醇高糖对照组(HG+mannitol)。用免疫细胞荧光双标鉴定大鼠RMPs,用荧光定量PCR技术和ELISA技术检测大鼠RMPs中Ang-2/Tie-2系统表达。结果高糖培养后,大鼠RMPs中Ang-2表达明显增加,Tie-2及磷酸化Tie-2明显降低,牛磺酸干预明显降低高糖组Ang-2表达,明显增加高糖组Tie-2及磷酸化Tie-2水平,呈剂量依赖关系。结论牛磺酸经调节Ang-2/Tie-2系统表达抑制糖尿病引起的视损伤。

嘌呤受体P2X_7对视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响

目的:探讨嘌呤受体P2X7在体外培养大鼠视网膜毛细血管周细胞上的功能意义。方法:利用显微镜下观察结合TUNEL计数法分别测定P2X7激动剂BzATP和拮抗剂OxATP对体外培养的正常视网膜毛细血管周细胞以及糖尿病大鼠视网膜毛细血管周细胞存活率的影响。结果:P2X7受体激动后可介导视网膜毛细血管周细胞死亡,糖尿病大鼠视网膜毛细血管周细胞较正常视网膜毛细血管周细胞,在同等激动剂浓度下或在同样的时间点,能引起更多的细胞凋亡。而拮抗剂OxATP可以明显减轻BzATP对视网膜毛细血管周细胞的毒性作用,提高其存活率。结论:P2X7受体活性对视网膜毛细血管周细胞凋亡有一定调控作用。

醛糖还原酶抑制剂和肌醇对糖尿病视网膜毛细血管周细胞的保护作用

目的观察醛糖还原酶抑制剂和肌醇对实验性糖尿病大鼠视网膜病变毛细血管周细胞的保护作用。方法给链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠分别管饲醛糖还原酶抑制剂或肌醇,于实验6个月末进行视网膜毛细血管消化铺片及透射电镜观察。结果糖尿病组的视网膜可见毛细血管内皮细胞/周细胞比值升高、无细胞毛细血管形成、周细胞线粒体肿胀、内皮细胞增生和毛细血管基底膜增厚;管饲醛糖还原酶抑制剂组的视网膜血管形态无明显改变;但管饲肌醇组的视网膜血管改变较管饲醛糖还原酶抑制剂组明显。结论醛糖还原酶抑制剂可有效预防实验性糖尿病性视网膜病变的形态学改变,肌醇能部分阻止视网膜形态学异常的发生。

基于预孵法纯化培养小鼠原代视网膜微血管周细胞

目的建立简便的小鼠原代视网膜微血管周细胞(RMPs)分离、纯化、培养方法.方法在体视显微镜下机械分离获取小鼠视网膜,并碎化、胶原酶消化、过滤处理,收集视网膜碎片,预孵24h后用接种于含有体积分数20%胎牛血清的低糖型DMEM6孔板进行培养,并采用差异消化法纯化原代RMPs.通过倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光法鉴定周细胞标志物,周细胞/内皮细胞共培养系统鉴定周细胞的功能.结果经预孵的视网膜碎片再次孵育24h后,细胞开始从视网膜碎片中迁移出,逐渐增生形成大小不一的细胞集落.原代或子代细胞胞体呈不规则三角形,多个长突触,无接触性抑制.免疫荧光显示第3代细胞绝大部分α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)表达阳性,极少部分胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,vonWillebrand因子(vWF)表达阴性,RMPs纯度达97%以上.体外培养的小鼠RMPs能被血管内皮细胞所募集,共同形成微血管样条索.结论本实验成功建立了一种简便的小鼠原代RMPs分离、纯化、培养方法,所培养的小鼠原代RMPs为功能性RMPs.

不同剂量血小板源性生长因子-B及黄芪注射液对体外高糖培养大鼠视网膜毛细血管周细胞的影响

目的观察不同剂量的血小板源性生长因子-B(PDGF-B)、不同剂量的黄芪注射液以及两者合用对体外高糖培养大鼠视网膜毛细血管周细胞(RMPs)生长的影响。方法取体外培养第3代大鼠RMPs,饥饿培养24 h后,分为空白组(5.5 mmol/L葡萄糖的低糖DMEM)、对照组(50 mmol/L葡萄糖的高糖DMEM)、不同浓度PDGF-B组(0.25 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL+高糖DMEM)、不同浓度黄芪注射液组(0.2 mg/mL、2 mg/mL、20 mg/mL、200 mg/mL+高糖DMEM)和PDGF-B+不同浓度黄芪注射液组(1.00 ng/mL PDGF-B+0.2 mg/mL、2 mg/mL、20 mg/mL、200 mg/mL黄芪注射液+高糖DMEM),培养48 h后,采用CCK8法检测各组RMPs增殖情况,并用免疫荧光法鉴定增殖后的细胞。结果与对照组比较,不同浓度PDGF-B组,2 mg/mL、20 mg/mL、200 mg/mL黄芪注射液组及1.00 ng/mL PDGF-B+2 mg/mL、20 mg/mL、200 mg/mL黄芪注射液各组均能促进体外高糖培养的RMPs增殖,并在一定浓度内呈剂量-效应关系,差异均有统计学意义(P均<0.05);其中1.00 ng/mL PDGF-B组及200 mg/mL黄芪注射液组促增殖作用均优于1.00 ng/mL PDGF-B+200 mg/mL黄芪注射液组(P均<0.05)。加药培养后各组细胞表达周细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及血小板源性生长因子受体-β(PDGFR-β),不表达血管性血友病因子(vWF),几乎不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论PDGF-B及黄芪注射液均对体外高糖培养大鼠RMPs的生长有促进作用,短期内未使RMPs发生变异,单用PDGF-B或黄芪注射液促生长作用优于两者合用。

高糖条件下人视网膜微血管周细胞的定量蛋白组学研究

目的利用定量蛋白组学技术探索高糖状态下人视网膜微血管周细胞(HRMPCs)的蛋白表达变化,为糖尿病视网膜病变(DR)早期周细胞缺失的机制研究提供新的蛋白靶点。方法将HRMPCs分为对照组和高糖组,分别用葡萄糖浓度为25 mmol/L和35 mmol/L的DMEM培养基培养48 h,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定各组HRMPCs活性。提取各组细胞的蛋白并进行酶切,得到肽段,取2μg肽段进行飞行时间质谱(TOF-MS)检测,质谱的采集模式为数据依赖性(DDA),对得到的蛋白表达信息进行生物信息学分析。结果高糖组的HRMPCs数量较对照组明显减少,且高糖组的部分细胞出现体积变小、变形等改变。CCK-8实验结果显示,高糖组HRMPCs吸光度(A 450)值为0.75±0.04,明显低于对照组的0.91±0.05,差异有统计学意义(t=5.784,P=0.000 2)。本研究共鉴定到1 972个可定量蛋白,其中差异蛋白有54个(差异倍数>1.5)。相比于对照组,高糖组细胞中上调的差异蛋白有13个,包括CTNNB1、CTBP2等,下调的差异蛋白有41个,包括SQSTM1、HMGCS1等。这些差异蛋白主要参与了三羧酸循环、有氧呼吸等生物学过程。结论高糖刺激HRMPCs会改变多种蛋白的表达,进而影响细胞的呼吸作用和ATP的生成,最终导致周细胞的缺失。

高糖对牛视网膜微血管周细胞P2X7及其下游活性氧簇、ATP产生和IL-6释放的影响

目的观察高糖对牛视网膜微血管周细胞(BRPs)P2X7及其下游活性氧簇(ROS)、ATP产生和IL-6释放的影响。方法将原代牛视网膜微血管周细胞分为4组:正常葡萄糖组(NG组,5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(HG组,30 mmol/L葡萄糖),NG+A438079组(P2X7受体拮抗剂A438079 HCl+5.5 mmol/L葡萄糖),HG+A438079组(P2X7受体拮抗剂A438079 HCl+30 mmol/L葡萄糖),分别检测P2X7受体的mRNA表达、蛋白表达水平及NG组和HG组加入P2X7受体激动剂前后ROS、ATP、IL-6的变化。结果高糖干预后,P2X7受体表达上调(P<0.05),ROS的产生、ATP消耗和IL-6释放均增多(P<0.05)。阻断P2X7后,ROS产生、ATP消耗和IL-6的释放显著减少(P<0.05)。结论高糖可经P2X7受体调节BRPs中ROS生成、ATP的产生和IL-6的释放。

黄蜀葵花治疗糖尿病视网膜病变的研究进展

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的主要微血管并发症之一,是全球中老年人视力丧失的主要原因[1]。最近的荟萃分析显示:DM人群中DR的总发生率约34.6%,其中增殖期糖尿病视网膜病变约6.96%,糖尿病性黄斑水肿约6.81%[2]。随着DM病程的延长,DR的发生率仍在增加[3],防治DR所需的医疗费用也在不断上升[1],积极探寻DR有效的干预手段对DM的整体防治具有极其重要的意义。祖国医学对DR的防治在长时间的临床实践中积累了丰富的经验,针对DR的治疗手段包含辨证治疗、分期治疗、专方专药、中药提取物、针灸、中药离子导入等多种方式[4]。

适用于中药醛糖还原酶抑制剂高通量筛选的细胞模型的建立

目的:建立一种适合中药醛糖还原酶抑制剂高通量筛选的细胞模型,以避免中药对传统离体筛选方法的干扰。方法:以视网膜周细胞、肾小球系膜细胞为研究对象,确定最佳孵育条件,并建立酶促微量反应法测定山梨醇含量,两者联动,建立细胞模型。结果:细胞孵育体系的最佳反应条件为30mmol·L-1葡萄糖孵育4h;酶促微量反应测定山梨醇含量的精密度、重现性良好,山梨醇浓度变化与荧光强度变化呈线性正相关,山梨醇浓度在6.25×10-6～2.5×10-4mol·L-1范围内线性关系良好。结论:该细胞模型能够排除中药对酶法测定醛糖还原酶活性的干扰,模拟体内的反应情况,使应用该模型进行的醛糖还原酶抑制剂筛选更具针对性,并适用于中药醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选。

纤维蛋白溶解酶对视网膜毛细血管周细胞生长调节的研究进展

鉴于纤维蛋白溶解酶（简称纤溶酶）在眼科临床应用广泛，尤其在辅助玻璃体切除术方面效果显著，因此研究纤溶酶对视网膜毛细血管周细胞的影响有助于更好理解糖尿病视网膜病变（DR）的发病机制；为治疗DR提供新途径；为纤溶酶安全有效的在玻璃体内注射辅助玻璃体切除手术提供理论依据。在此综述了纤溶酶对周细胞的生长调节、作用机制及其在眼科临床应用方面的最新研究进展。

氨基胍、水飞蓟素、山莨菪碱对糖基化产物培养下周细胞增殖和胞浆钙改变的保护作用

目的 探讨氨基胍 (aminoguanidine,AG)水飞蓟素 (silymarin,Sil)和山莨菪碱 (anisodamine,Ani)对糖基化产物培养下视网膜微血管周细胞 (pericytes,PC)的保护作用。 方法 MTT比色测定结合3 H- Td R掺入和 Fura- 2 AM,观察三种药物对早期糖基化产物 (early glycation products of albumin,EGs)和糖基化终产物 (advanced glycation end products of albumin AGEs)培养的 PC增生、DNA合成和胞浆[Ca2 +]i水平改变的影响。结果 EGs培养下 ,AG组和 Sil组 MTT测定 A值和 3 H- Td R掺入量均较对照组增高 (P<0 .0 1) ,而两组胞浆 [Ca2 +]i水平较对照组减低 (P<0 .0 1和 0 .0 5 ) ,两组比较差异具有显著性的意义 ;AGEs培养下 ,仅 AG组 MTT A值和 3 H- Td R掺入量较对照组增高 (P<0 .0 1) ,胞浆 [Ca2 +]i水平较对照组减低 (P<0 .0 5 )。 结论 AG能有效保护 PC免受 EGs所致的增生和抑制胞浆 [Ca2 +]i水平增高 ,并对 AGEs所致的上述改变亦有一定的保护效应。 Sil仅对 EGs所致的 PC增生抑制和胞浆 [Ca2 +]i水平改变有一定的保护作用 ;Ani对 EGs和 AGEs所致的 PC上述改变均无明显保护作用。

基于TOPSIS法综合评价补肾活血方不同极性部位治疗DR的效果

目的:基于TOPSIS法综合评价补肾活血方不同极性部位对糖尿病视网膜病变(DR)的治疗作用。方法:依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水提取补肾活血方得到不同极性部位提取物。比较不同极性部位给药后大鼠视网膜消化铺片,免疫组化法检测VEGF和HIF-1α的蛋白表达,ELISA法测定血浆AGEs浓度,采用TOPSIS法综合评价不同极性部位对DR的治疗作用。结果:与空白组比较,模型组各检测结果均具有显著性差异;与模型组比较,各给药组对DR大鼠视网膜微血管内皮细胞与周细胞比值明显降低,血浆AGEs浓度明显降低,视网膜VEGF、HIF-1α蛋白表达下调。TOPSIS法综合评价结果显示各不同极性部位给药组得分按高低排序为三氯甲烷组>正丁醇组>石油醚组>乙酸乙酯组>水部位组,表明三氯甲烷部位对DR改善效果最佳,水部位效果最差。结论:补肾活血方不同极性部位对DR有不同程度的改善作用,其中三氯甲烷部位对DR治疗效果最优;基于TOPSIS法可公正、客观地评价补肾活血方不同极性部位治疗DR的药效作用。