视网膜母细胞瘤患儿血清LncRNA-NEAT1水平表达及对瘤细胞生物学功能的影响

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)核富集转录体1(nuclera-enriched autosomaltranscript,NEAT1)在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)患儿血清中表达,以及下调Rb细胞Y79中NEAT1对细胞生物学功能的影响。方法以2015年3月~2021年3月鄂东医疗集团黄石市中心医院诊疗的83例Rb患儿为研究对象,同期,在儿童保健中心选取健康儿童50例(对照组),实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测血清中NEAT1表达,分析Rb患儿和对照组血清NEAT1表达差异,以及不同临床指标Rb患者血清中NEAT1表达差异。培养Y79细胞并分为si-NEAT1组(转染NEAT1的干扰序列)、si-NC组(转染对照序列)和Ctl组(仅加入转染试剂),分别使用qRT-PCR,MTT,流式细胞术和Transwell检测NEAT1表达、细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭情况。结果Rb患儿血清中NEAT1表达量(1.43±0.28)高于对照组(1.01±0.21),差异具有统计学意义(t=9.116,P<0.001);国际视网膜母细胞瘤分期(Intraocular International Retinoblastoma classificaton,IIRC)CDE期、低分化、视神经浸润和淋巴结转移的Rb患儿血清中NEAT1表达量明显高于AB期、中高分化、未发生视神经浸润和淋巴结转移的Rb患儿,差异具有统计学意义(t=2.190~3.693,均P<0.05);血清中NEAT1表达诊断Rb曲线下面积为0.882(95%CI:0.826~0.937),当NEAT1表达量取1.20时,灵敏度和特异度分别为80.00%和79.52%;相比于si-NC组(1.03±0.09)和Ctl组(1.02±0.15),si-NEAT1组细胞中NEAT1表达(0.35±0.06)明显降低,差异具有统计学意义(t=14.829,9.994,均P<0.001);si-NEAT1组24,48,72和96 h时吸光度(A值)明显低于si-NC组和Ctl组(tsi-NC=2.796~4.362,tCtl=2.641~5.555,均P<0.05),而细胞凋亡率相比于si-NC组和Ctl组明显升高,差异具有统计学意义(t=4.999,3.915,均P<0.05);与si-NC组和Ctl组比较,si-NEAT1组迁移细胞数(116.50±9.35 vs 132.00±7.32,134.00±7.95)和侵袭细胞数(96.33±8.94 vs 117.67±12.39,119.17±10.05)均降低,差异具有统计学意义(tsi-NC=3.196,3.421,tCtl=3.492,4.159,均P<0.05)。结论Rb患儿血清中NEAT1表达量升高,对Rb患儿具有一定的诊断价值,沉默Y79细胞中NEAT1表达可减少Rb细胞增殖、加速细胞凋亡,同时抑制细胞迁移和侵袭。

血清LncRNA NEAT1、TFF1在视网膜母细胞瘤中的表达及预后评估价值

目的分析视网膜母细胞瘤(Rb)患儿血清长链非编码RNA核内富集转录物1(LncRNA NEAT1)、三叶因子1(TFF1)表达及预后评估价值。方法选取2018年1月—2021年1月首都医科大学附属北京安贞医院南充医院眼科手术治疗的Rb患儿85例作为Rb组,以同期体检健康者60例为健康对照组。采用实时荧光定量PCR检测血清LncRNA NEAT1水平,采用酶联免疫吸附试验检测血清TFF1;分析血清LncRNA NEAT1、TFF1与临床病理特征的关系;Cox回归分析Rb预后影响因素;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清LncRNA NEAT1、TFF1对Rb患儿预后的评估价值。结果Rb组血清LncRNA NEAT1水平高于健康对照组,血清TFF1低于健康对照组(t/P=38.305/<0.001、34.858/<0.001)。与肿瘤直径<20 mm、病理分化型Rb患儿比较,肿瘤直径≥20 mm、未分化型Rb患儿血清LncRNA NEAT1较高,TFF1较低(LncRNA NEAT1:t/P=17.925/<0.001,16.848/<0.001;TFF1:t/P=12.505/<0.001,8.120/<0.001)。血清LncRNA NEAT1高表达组3年无进展生存率低于低表达组(57.50%vs.88.89%),TFF1低表达组3年无进展生存率低于高表达组(57.14%vs.90.70%)(Log rankχ^(2)/P=13.551/<0.001、15.310/<0.001)。病理未分化型、血清LncRNA NEAT1升高是影响Rb预后的危险因素,血清TFF1升高是其保护因素[HR(95%CI)=1.523(1.147~2.024),1.473(1.108~1.957),0.612(0.413~0.908)];血清LncRNA NEAT1、TFF1及二者联合预测Rb预后的曲线下面积分别为0.836、0.861、0.921,二者联合大于血清LncRNA NEAT1、TFF1单项检测(Z=4.823、4.312,P均<0.001)。结论Rb患儿血清LncRNA NEAT1升高,血清TFF1水平降低,两者与肿瘤最大径及病理分型有关,均是影响Rb患儿预后的因素,两者联合有助于评估患者预后。

lncRNA HIF1A-AS1对长春新碱耐药视网膜母细胞瘤细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨长链非编码RNA-HIF1A-AS1(lncRNA HIF1A-AS1)调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达对长春新碱(VCR)耐药视网膜母细胞瘤(RB)细胞化疗敏感性的影响。方法:建立人RB VCR耐药细胞株SO-RB50/VCR,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测SO-RB50与SO-RB50/VCR细胞lncRNA HIF1A-AS1表达;在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达或同时过表达HIF-1α,检测SO-RB50/VCR细胞对VCR的半数抑制浓度(IC_(50))及细胞增殖、凋亡情况;Western blot检测HIF-1α、多药耐药相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达。结果:与SO-RB50细胞相比,SO-RB50/VCR细胞中lncRNA HIF1A-AS1与HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05);在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达后,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),细胞吸光度(OD_(450))值显著降低,VCR对细胞的IC_(50)值及HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05);过表达HIF-1α可减弱下调lncRNA HIF1A-AS1表达对SO-RB50/VCR细胞耐药性的抑制作用。结论:lncRNA HIF1A-AS1在SO-RB50/VCR细胞中高表达,抑制lncRNA HIF1A-AS1表达可通过下调HIF-1α表达,降低SO-RB50/VCR细胞对VCR的耐药性。

LncRNA FAM83A-AS1通过miR-150/HMGA2轴对视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)序列相似家族83成员A-反义核糖核酸1(FAM83AAS1)在视网膜母细胞瘤(RB)细胞中的作用及其潜在的分子机制。方法体外培养RB细胞,将Vector、pcDNA-FAM83A-AS1、NC-siRNA、FAM83A-AS1-siRNA分别转染至细胞中(依次为pcDNA-FAm83A-AS1组、NC-siRNA组、FAm83A-AS1-siRNA组),检测RB细胞中FAM83A-AS1的表达、RB细胞增殖能力、凋亡率。生物信息学方法和双荧光素酶报告基因实验预测和验证FAM83A-AS1与miR-150以及miR-150与高迁移率族蛋白A2(HMGA2)的靶向关系。RT-qPCR检测RB细胞中miR-150、HMGA2 mRNA的表达;Western blot检测RB细胞中HMGA2蛋白的表达;MTT实验和流式细胞术检测转染后RB细胞增殖和凋亡能力。结果pcDNA-FAM83A-AS1组细胞中FAM83A-AS1的表达显著高于Vector组,低于NC-siRNA组(P<0.05)。pcDNA-FAM83A-AS1组较Vector组的细胞增殖能力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。FAM83AAS1-siRNA组较NC-siRNA组的细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。miR-150 mimic可显著抑制RB细胞增殖能力,促进细胞凋亡。而pcDNA-HMGA2可显著逆转miR-150 mimic对RB细胞增殖和凋亡的作用。结论敲低lncRNA FAM83A-AS1通过调控miR-150/HMGA2轴抑制RB细胞增殖,促进细胞凋亡。

视网膜母细胞瘤结合锌指蛋白1调控肥胖和肿瘤信号通路研究综述

视网膜母细胞瘤结合锌指蛋白1(retinoblastoma-interacting zinc finger protein 1,RIZ1)基因,又称PRDM2(positive regulatory domain 2)基因,是PRDM基因家族一员,其蛋白序列包含1个PR结构域、1个核激素受体结合基序、8个锌指结构域和1个视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)相互作用基序。RIZ1主要定位于细胞核内,在核内发挥转录抑制因子、基因调控、蛋白质-蛋白质相互作用等功能。RIZ1是代谢通路的重要参与者,其通过调控代谢相关基因影响基础代谢,抑制肥胖的形成;RIZ1功能突变或含量不足与多种肿瘤发生发展相关,其通过激活下游致癌基因或调控代谢参与肿瘤进程。RIZ1通过v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅲ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3,AKT3)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1),以及作为协同激活剂等方式分别调控AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、IGF-1、雌激素这3条肿瘤和肥胖相关分子信号通路。3条分子通路功能有差异且其下游分子存在交叉,提示RIZ1在不同年龄、性别和器官中的作用可能不同。详细研究RIZ1与RIZ2在代谢进程中的调控作用有助于全面了解RIZ1参与肥胖和肿瘤形成的机制。未来基于RIZ1靶点进行诊断研究或功能恢复可能对代谢性疾病和肿瘤的诊断和治疗有重要意义。

circROBO1对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及其机制

目的探讨circROBO1对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及其机制。方法体外传代培养视网膜母细胞瘤细胞Y79。取传2代、对数生长期、生长状态良好的Y79细胞,随机分为si-circROBO1组、si-control组,分别转染si-circROBO1、si-control。转染6 h,继续培养24 h,收集细胞,采用RT-qPCR法检测circROBO1表达,采用CCK-8法检测细胞活力,采用细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力。通过CircInteractome在线网站预测circROBO1与miR-217的结合位点,并采用双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验验证两者的靶向调控关系。结果si-circROBO1组circROBO1相对表达量显著低于si-control组(P<0.05)。si-circROBO1组细胞活力、克隆形成率均显著低于si-control组(P均<0.05)。经CircInteractome在线网站预测,circROBO1序列中可能存在两个与miR-217结合的位点。经双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验验证,共转染野生型circROBO1和miR-217可降低Y79细胞荧光素酶活性,并且miR-217主要富集在野生型circROBO1 MS2bs载体转染的Y79细胞中。结论circROBO1可能通过靶向调控miR-217促进视网膜母细胞瘤细胞增殖。

LncRNA LUCAT1靶向miR-502-5p对人视网膜母细胞瘤细胞生物学行为的影响

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)肺癌相关转录产物1(LUCAT1)靶向微小RNA(miR)-502-5p对人视网膜母细胞瘤(RB)细胞增生、迁移和侵袭的影响。方法收集2019年5月至2021年1月在河南省立眼科医院确诊并行眼球摘除术的27例RB患者的RB组织样本,正常视网膜组织标本(12例眼球破裂伤、7例眼球萎缩、8例眼球穿通伤合并有色素膜嵌顿)取自同期在河南省立眼科医院行眼球摘除术的27例患者。采用实时荧光定量PCR检测LncRNA LUCAT1和miR-502-5p在RB组织、细胞系(Y-79、WERI-Rb-1、HXO-RB44)及人视网膜上皮细胞(ARPE-19)中的表达。将RB细胞Y-79分为对照组、小干扰RNA(si)-LncRNA LUCAT1组、si-对照(con)组、pcDNA组、pcDNA-LncRNA LUCAT1组、miR-con组、miR-502-5p组、si-LncRNA LUCAT1+anti-miR-con组和si-LncRNA LUCAT1+anti-miR-502-5p组,分别转染相应试剂。采用Western blot法检测MMP2和MMP9蛋白表达;采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增生活力;采用克隆形成实验检测细胞增生能力;采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。采用双荧光素酶报告实验和实时荧光定量PCR验证LncRNA LUCAT1对miR-502-5p的靶向调控作用。结果RB组织中LncRNA LUCAT1表达量为2.73±0.34,明显高于正常视网膜组织的1.00±0.15;miR-502-5p表达量为0.42±0.06,明显低于正常视网膜组织的1.00±0.13,差异均有统计学意义(t=24.190、21.049,均P<0.001)。人RB细胞系Y-79、WERI-Rb-1和HXO-RB44中LncRNA LUCAT1表达水平明显高于ARPE-19细胞,miR-502-5p表达水平明显低于ARPE-19细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。si-LncRNA LUCAT1组LncRNA LUCAT1表达量,MMP2、MMP9蛋白相对表达量,吸光度(A)值,细胞增生、迁移、侵袭数量较对照组均明显减少,差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-502-5p组miR-502-5p表达量高于miR-con组,MMP2、MMP9蛋白相对表达量,细胞活力A值,细胞增生、迁移、侵袭数量少于miR-con组,差异均有统计学意义(t=20.274、14.884、14.181、12.692、17.749、20.889、21.913,均P<0.001)。si-LncRNA LUCAT1+anti-miR-502-5p组miR-502-5p表达量低于si-LncRNA LUCAT1+anti-miR-con组,MMP2、MMP9蛋白相对表达量,细胞活力A值,细胞增生、迁移、侵袭数量高于si-LncRNA LUCAT1+anti-miR-con组,差异均有统计学意义(t=14.097、15.839、15.757、11.860、16.235、16.565、16.487,均P<0.001)。与LncRNA LUCAT1-野生型共转染时,miR-502-5p组相对荧光素酶活性值低于miR-con组,差异有统计学意义(t=16.379,P<0.001)。pcDNA-LncRNA LUCAT1组LncRNA LUCAT1表达量高于pcDNA组,miR-502-5p表达量低于pcDNA组,si-LncRNA LUCAT1组LncRNA LUCAT1表达量低于si-con组,miR-502-5p表达量高于si-con组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论抑制LncRNA LUCAT1表达通过靶向上调miR-502-5p可减弱人RB细胞的增生、迁移和侵袭能力。

骨髓增生异常综合征患者外周血单个核细胞中视网膜母细胞瘤蛋白结合锌指结构基因1的表达

目的探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中视网膜母细胞瘤蛋白结合锌指结构基因1(RIZ1)的表达及其临床意义。方法选取2012年7月至2015年7月于新乡医学院第一附属医院收治的MDS患者86例为研究对象(MDS组),并选取同期体检健康者90例作为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测PBMC中RIZ1蛋白及其mRNA表达水平,并分析RIZ1表达与MDS患者临床病理特征的关系。结果对照组和MDS组受试者PBMC中RIZ1 mRNA表达水平分别为1.73±0.41和0.47±0.18,MDS组患者PBMC中RIZ1 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)。对照组和MDS组受试者PBMC中RIZ1蛋白表达水平分别为1.32±0.36和0.35±0.22,MDS组患者PBMC中RIZ1蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。RIZ1蛋白表达与MDS患者的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白水平及血小板计数无关(P>0.05),而与骨髓原始细胞比例、世界卫生组织(WHO)分型及染色体核型有关(P<0.05)。结论 RIZ1在MDS患者PBMC中呈低水平表达,并与患者的骨髓原始细胞比例、WHO分型及染色体核型显著相关,这为MDS的早期诊断和靶向治疗提供了新的思路。

Bmi-1基因沉默对人视网膜母细胞瘤SO-RB_(50)细胞生长的体外抑制作用

【目的】探讨体外沉默Bmi-1基因对人视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞增殖和凋亡的影响。【方法】免疫组织化学和RT-PCR分别检测Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中的表达。体外化学合成法合成的靶向Bmi-1基因的siRNA双链转染培养的人SO-RB50瘤细胞。荧光定量RT-PCR和western-blot分别检测转染Bmi-1 siRNA后的人SO-RB50瘤细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白水平的变化。MTT法测定Bmi-1基因干扰后SO-RB50瘤细胞增殖情况。流式细胞仪检测Bmi-1 siRNA对人SO-RB50瘤细胞凋亡的影响。【结果】免疫组化和RT-PCR显示Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。人SO-RB50瘤细胞经Bmi-1沉默处理后,与阴性对照组相比,Bmi-1在mRNA和蛋白水平抑制率分别为(83.9±3.2)%和(82.8±1.1)%。MTT结果显示干扰组细胞在第3天增殖抑制作用最明显,抑制率达(52.5±1.9)%。干扰组人SO-RB50瘤细胞凋亡率为(20.7±1.1)%,阴性组细胞凋亡率为(1.9±0.2)%,两者有统计学差异。【结论】Bmi-1特异性siRNA能显著抑制人SO-RB50瘤细胞Bmi-1基因的表达,抑制细胞生长,可能通过促进瘤细胞凋亡而起作用,Bmi-1基因可能为RB治疗的新靶点。

抑制lncRNA HIF1A-AS1表达对长春新碱耐药视网膜母细胞瘤细胞株裸鼠移植瘤生长及转移的影响

目的探讨抑制长链非编码RNA(lncRNA)缺氧诱导因子1α-反义RNA1(HIF1A-AS1)表达对长春新碱(VCR)耐药视网膜母细胞瘤(Rb)细胞株裸鼠的生存期、移植瘤生长和转移的影响。方法体外培养人Rb细胞株HXO-RB44、Y79、SO-RB50,通过逐步增加VCR浓度的方法刺激诱导建立其相应的VCR耐药Rb细胞HXO-RB44/VCR、Y79/VCR、SO-RB50/VCR,以实时荧光定量PCR(qPCR)实验检测上述细胞中lncRNA HIF1A-AS1、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达。于裸鼠背部皮下注射Y79/VCR细胞悬液建立VCR耐药Rb细胞株裸鼠模型,随机分为模型组、VCR组、VCR+lncRNA HIF1A-AS1敲低组、VCR+lncRNA HIF1A-AS1空载组,以VCR和相应质粒分组干预处理后,检测各组裸鼠移植瘤的肿瘤体积、抑瘤率、转移情况及存活率;qPCR实验检测各组裸鼠移植瘤lncRNA HIF1A-AS1及HIF-1α、多药耐药1(MDR1)、乳腺癌相关耐药蛋白(BCRP/ABCG2)mRNA表达;免疫印迹法检测VCR耐药Rb细胞株裸鼠移植瘤HIF-1α、P-gp、ABCG2蛋白表达。结果与人Rb正常细胞HXO-RB44、Y79和SO-RB50相比,lncRNA HIF1A-AS1、HIF-1α在其相应VCR耐药细胞HXO-RB44/VCR、Y79/VCR、SO-RB50/VCR中的表达均显著升高(P<005)。与模型组比较,VCR+lncRNA HIF1A-AS1敲低组VCR耐药Rb细胞株裸鼠移植瘤肿瘤体积、转移器官数、转移灶总数、lncRNA HIF1A-AS1及HIF-1α、MDR1、ABCG2 mRNA表达、HIF-1α及P-gp、ABCG2蛋白表达均显著降低(P<005),裸鼠给药后30 d存活率、抑瘤率显著升高(P<005);VCR组、VCR+lncRNA HIF1A-AS1空载组VCR耐药Rb细胞株裸鼠各指标无显著变化(P>005)。与VCR组比较,VCR+lncRNA HIF1A-AS1敲低组VCR耐药Rb细胞株裸鼠移植瘤肿瘤体积、转移器官数、转移灶总数、lncRNA HIF1A-AS1及HIF-1α、MDR1、ABCG2 mRNA表达、HIF-1α及P-gp、ABCG2蛋白表达均显著降低(P<005),裸鼠给药后30 d存活率、抑瘤率显著升高(P<005);VCR+lncRNA HIF1A-AS1空载组VCR耐药Rb细胞株裸鼠各指标无显著变化(P>005)。结论下调lncRNA HIF1A-AS1表达可降低HIF-1α表达,增强VCR耐药Rb细胞株裸鼠移植瘤对VCR的敏感性,抑制移植瘤的生长和转移,提高裸鼠存活率。

miR-26a在Y79视网膜母细胞瘤细胞系内下调抑癌基因Rb1表达

目的探讨视网膜母细胞瘤细胞系内抑癌基因Rb1表达下调的分子机制。方法本研究利用real-time PCR和Western blotting等方法分别检测miR-26a和Rb1基因的表达。结果本研究结果显示在人视网膜母细胞瘤组织细胞与正常人视网膜血管内皮细胞间比较,miR-26a表达差异有统计学意义(P<0.005)。miR-26a可以通过与Rb1基因的3'UTR作用而导致人视网膜母细胞瘤细胞内Rb1基因表达下降。结论在Y79 Rb细胞内miR-26a下调抑癌基因Rb1的表达。

Rb1基因在双眼视网膜母细胞瘤病人体细胞中杂合性突变的检测

目的对５０例眼视网膜母细胞瘤（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ，ＲＢ）病人进行外周血体细胞Ｒｂ１基因杂合性突变的检测工作。方法ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（单链构像多态分析）直接测序技术。结果改进的方法可以检测出Ｒｂ１基因１～１０个碱基的多种类型的微小突变。结论可将此快速、敏感、有效的方法用于阐明Ｒｂ１基因突变机制并可以对此类病人及家系在分子水平上进行ＲＢ的产前诊断、产后早期诊断及遗传咨询。

RNAi沉默ROCK-1基因抑制人视网膜母细胞瘤细胞株Y79的增殖、侵袭和转移

目的探讨利用RNA干扰技术(RNAi)沉默人视网膜母细胞瘤Y79细胞株ROCK-1基因对细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法实验设空白对照组、阴性脂质体组、实验组。转染后48 h,采用半定量RT-PCR检测ROCK-1、MMP9和CXCR4 mRNA的相对表达变化,采用Western blot检测ROCK-1、MMP9和CXCR4蛋白的表达变化。采用MTT法在转染后24 h、48 h、72 h分别检测细胞的生长情况。采用Transwell小室检测转染后细胞的侵袭和迁移能力。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组细胞ROCK-1、MMP9和CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下调;细胞生长活力显著下降、凋亡比率显著增加;基因沉默显著抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,差异均具有统计学意义。结论应用ROCK-1-siRNA转染人视网膜母细胞瘤Y79细胞株,可有效抑制细胞的增殖、侵袭和迁移。小干扰RNA治疗有望成为人视网膜母细胞瘤靶向治疗的新手段。

关注RB1基因突变检测在视网膜母细胞瘤诊疗及遗传咨询中的作用

视网膜母细胞瘤（RB）是人类遗传型肿瘤的原型，是常见的儿童眼内恶性肿瘤，其发生和发展与肿瘤抑制基因RB1基因的突变密切相关。RB1基因突变检测和遗传咨询有助于为患者及其家庭提供理想的诊疗及随访方案。在2017年最新的第8版国际TNM肿瘤分期标准中，首次把遗传性（H）作为RB的临床分期标准，这是国际上首个TNMH分期标准。但目前由于RB1基因突变的复杂性、现有基因检测方式的局限性、遗传咨询人才的缺乏等原因，RB1基因突变检测在中国的开展水平还比较低。在中国大力发展精准医学的时代，眼科医师应加倍努力，推动RB1基因突变检测在中国的应用。

5-Aza-CdR对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株中RASSF1A基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株中RASSF1A基因启动子区域甲基化状态及其表达的影响。方法不同浓度的5-Aza-CdR对HXO-RB44细胞进行化学干预72h后用无药物完全培养基培养72h,MTT法检测不同浓度5-Aza-CdR对于HXO-RB44细胞的生长抑制率;甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测RASSF1A基因启动子区域甲基化状态的改变;RT-PCR观察RASSF1A基因mRNA水平变化;Western blot检测RASSF1A蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期以及凋亡。结果 0.5μmol.L-1、1.0μmol.L-1、2.0μmol.L-1和5.0μmol.L-1的5-Aza-CdR对HXO-RB44细胞的生长抑制率分别为(9.37±3.53)%、(25.72±2.35)%、(39.88±4.32)%和(76.50±0.94)%,各组之间差异具有统计学意义;经5-Aza-CdR干预后,RASSF1A基因启动子区域由高甲基化状态转变为非甲基化状态,仅0.5μmol.L-15-Aza-Cd就可逆转RASSF1A基因的高甲基化状态;RT-PCR和Western blot结果显示在干预组细胞中分别出现RASSF1A基因的DNA条带(329bp)和蛋白质条带(相对分子质量39×103),而对照组中没有相应条带出现;各组之间RASSF1A mRNA以及蛋白的表达差异均具有显著性统计学意义;流式细胞术显示药物处理后细胞周期出现G0/G1期阻滞,并出现显著的细胞凋亡。结论 DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR能够诱导RASSF1A基因启动子区域去甲基化,并通过该机制诱导RASSF1A基因在人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44中的表达。

母系遗传性视网膜母细胞瘤家系RB1基因分析与产前诊断

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB;OMIM180200）是一种来源于未成熟视网膜细胞的恶性罕见肿瘤,是最早发现的由基因突变而导致的肿瘤,该致病基因被命名为视网膜母细胞瘤基因1（RB1）,因此RB1也成为了第一个被成功克隆的人类抑癌基因。已有研究表明,90%的双眼和15%的单眼RB患者外周血基因组DNA中均能检测到RB1基因致病性杂合突变。

国人视网膜母细胞瘤患者RB1基因突变的特性

目的:检测国人RB患者体细胞中RB1基因突变,分析我国RB1基因突变的特性,探讨RB1基因突变的分子生物学机制。方法:应用PCR—SSCP技术筛查28例RB患者及亲属的白细胞基因组DNA,测序分析确定突变。结果:共确定7例RB1基因生殖细胞性突变。结论:本组RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失,这些突变改变了RB1基因的遗传信息,致使异常的RB1基因蛋白产生,导致视网膜母细胞瘤的发生。中国RB1基因突变方式主要是以微小突变为主,但复杂突变的比例相对较高。

1株RB1^(+/+)的中国汉族人视网膜母细胞瘤细胞系的建立与基因组特征研究

目的·建立1株新的中国汉族人视网膜母细胞瘤细胞系,并研究其基本特征。方法·在无菌环境中,从1例视网膜母细胞瘤患者瘤体标本中分离原代肿瘤细胞,进行培养、纯化与传代。通过细胞免疫荧光、免疫组织化学染色、DNA短片段重复序列(short tandemrepeat,STR)检测、核型分析和全外显子测序等方法,观察并鉴定该细胞系和肿瘤组织形态学特征、遗传学特征及表面标志物。结果·将该细胞系命名为SNPH-Rb-C24,其主要特征为神经起源的肿瘤细胞,表达神经细胞黏附分子1和突触素;STR分型与原肿瘤组织个体来源一致;染色体核型发生复杂改变,但未发现13号染色体长臂改变;与原肿瘤组织皆表现为RB1^(+/+)特征,且基因突变谱相似;具有体内成瘤能力。结论·成功建立1株起源于RB1^(+/+)中国汉族人视网膜母细胞瘤细胞系SNPH-Rb-C24,该细胞系保留了原肿瘤组织的生物学和遗传学特征。

视网膜母细胞瘤患者RB1基因突变筛选

目的:了解视网膜母细胞瘤患者RB1基因的突变特点。方法:应用PCR-SSCP技术筛查RB患者白细胞基因组DNA,测序分析确定突变。结果:在RB患者10例中,确定双眼RB患者1例第8外显子37位核苷酸A→T突变,引起12位谷氨酸变为天门冬酰氨酸(G12A)。其母亲同样为第8外显子36位核苷酸A→T突变,引起12位谷氨酸变为天门冬酰氨酸(G12A)。结论:本组双眼RB患者1例为遗传性,其RB1基因突变为微小突变,其母亲为突变基因携带者,本研究为遗传咨询提供一些有价值的资料。

变性高效液相色谱检测视网膜母细胞瘤Rb1基因外显子

目的探讨变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)检测视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)Rb1基因外显子突变的情况。方法收集25例RB患者的肿瘤组织和3例健康者的外周血。提取其基因组,扩增Rb1基因的第3、7、9、12和26个外显子片段,再以DHPLC和DNA直接测序法分别检测其突变情况并进行比较。结果所有模板均扩增出5个外显子片段。DHPLC分析得第3、7、9、12和26个外显子的最优化检测柱温分别为54.4、55.2、53.4、53.4和55.2℃;第3、7、9和12个外显子中,25例患者和3例健康者均呈现同样峰形;而第26个外显子中,有2例患者呈现不同峰形。对所有片段进行测序,第3、7、9和12外显子的扩增片段中未发现突变。而外显子26的扩增片段中,DHPLC峰形和其他片段不同的2个样品也未出现突变。DHPLC和直接测序结果的差异无统计学意义(P>0.05)。结论DHPLC能快速检测出Rb1基因外显子片段的突变位点,可以用于RB的检测。