血管内皮生长因子受体3在视网膜母细胞瘤Rb50中的表达及其意义

目的:在蛋白水平及基因水平检测视网膜母细胞瘤细胞株血管内皮生长因子受体VEGFR3的表达。方法:通过S-P免疫组化、RT-PCR、载体构建及基因测序等方法,研究VEGFR3在Rb50上的表达。结果:S-P免疫组化法呈阳性结果,RT-PCR扩增出313bp强表达条带,与载体pGEX-6P-3正确连接,经基因测序与VEGFR3基因序列一致。结论:视网膜母细胞瘤Rb50细胞株在基因水平及蛋白水平均有VEGFR3的表达,为研究VEGF-C/VEGFR3信息通路对视网膜母细胞瘤生长、浸润的影响打下了基础。

视网膜母细胞瘤Rb50细胞株VEGFR-3表达的研究

目的:研究视网膜母细胞瘤细胞株VEGFR-3的表达,探讨视网膜母细胞瘤自身增殖的机制。方法:选择Rb50细胞株,通过S-P免疫组化法、RT-PCR法及PCR产物琼脂糖凝胶电泳等方法,研究Rb50细胞株VEGFR-3的表达情况。结果:S-P免疫组化法呈阳性结果,表明Rb50细胞株有VEGFR-3的表达,RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳表明Rb50细胞株有较高水平VEGFR-3 mRNA的存在。结论:视网膜母细胞瘤细胞株有VEGFR-3的表达,表明VEGFR信息通路对视网膜母细胞瘤生长、浸润的影响,除了与促进肿瘤血管及淋巴管新生,改善肿瘤组织微环境相关外,还与促进肿瘤细胞自身增殖有关。

FG020318对视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50多药耐药的逆转作用

目的:研究2-[4-(2-嘧啶-2-乙烯基)-苯基]-4,5-双丙稀酰胺-(4,N,N-二乙胺苯基)-1(H)-咪唑(FG020318)对视网膜母细胞瘤耐药细胞株SO-Rb50/VCR的逆转作用。方法:通过体外浓度递增法诱导建立耐长春新碱细胞株SO-Rb50/VCR,采用MTT药敏试验及流式细胞术测定细胞内罗丹明123浓度的方法研究FG020318和环孢霉素A对耐药株多药耐药的逆转作用。结果:FG020318(2.5μmol/L)即可明显降低SO-Rb50/VCR的半数致死有效浓度(IC50)值和增加多药耐药(MDR)细胞内罗丹明123的浓度,且上述作用随浓度的增加而增强。在相同浓度时,FG020318对SO-Rb50/VCR的逆转倍数要高于环孢霉素。结论:一种新的肿瘤耐药逆转剂FG020318可部分逆转耐药细胞株SO-Rb50/VCR的耐药性,可能是一种很有希望的逆转MDR的新药。

视网膜母细胞瘤SO-RB_(50)瘤细胞NOD-SCID鼠皮下异位移植全身转移瘤模型的建立

目的:建立人视网膜母细胞瘤(RB)的严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficent)小鼠(NOD-SCID鼠)皮下移植模型,并探讨RB转移的发生、分布规律.方法:NOD-SCID小鼠皮下接种人视网膜母细胞SO-RB50细胞,定期观察小鼠的行为及肿瘤的形成、生长、转移.采用HE,免疫组织化学染色方法,对皮下肿瘤原发灶及远处转移灶行病理组织学研究.结果:皮下接种小鼠肿瘤生长的潜伏期为12～19d,成瘤为100%,5只鼠有远处转移灶,发生转移的时间在32d后,时间分布不一,肿瘤转移灶主要分布在腹腔和肾旁,小鼠的异种移植瘤和转移灶组织形态上与人类的RB一致,光镜下细胞胞质少、核深染、可见病理性核分裂,为未分化型.结论:NOD-SCID小鼠的荷瘤人视网膜母细胞瘤模型,成瘤率高,成瘤潜伏期短,较高转移率的特点.

过表达长链非编码RNA MT1JP抑制视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞的增殖、侵袭和体内移植瘤的生长

目的探讨过表达长链非编码RNA MT1JP抑制视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞的增殖、侵袭和体内移植瘤的生长机制。方法体外培养视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞,并分为空白对照组(control组)、转染对照组(Vector组)及过表达组(MT1JP组);采用RT-PCR检测各组MT1JP的表达;克隆形成检测各组SO-RB50细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Transwell检测细胞侵袭情况;Western blot检测Ki67、VEGF蛋白表达情况。小鼠皮下注射SO-RB50细胞,建立移植瘤模型;RT-PCR检测长链的表达;统计裸鼠生存时间,绘制生存曲线;检测小鼠肿瘤重量;免疫组化检测小鼠肿瘤组织中Ki67和VEGF的表达情况。结果与空白对照组比较,转染对照组的MT1JP表达、单位面积细胞侵袭数目、Ki67、VEGF蛋白表达均无显著变化(P>0.05);与转染对照组比较,过表达组MT1JP的表达、细胞凋亡率显著升高(P>0.05),克隆实验细胞形成率、Ki67、VEGF蛋白表达、单位面积细胞侵袭数目显著降低(P<0.05);小鼠体内实验显示:与空白对照组比较,转染对照组小鼠肿瘤质量、生存期、Ki67、VEGF蛋白表达均无显著差异(P>0.05);相比转染对照组,过表达组小鼠MT1JP表达、小鼠生存率显著提高(P<0.05);肿瘤质量、Ki67、VEGF蛋白表达显著降低(均P<0.05)。结论过表达长链非编码RNA MT1JP可以抑制视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞的增殖、侵袭,促进SO-RB50细胞的凋亡并抑制体内移植瘤的生长。

Rb基因对人视网膜母细胞瘤株SO-Rb50的影响

目的：探讨视网膜母细胞瘤（Rb）的发生与Rb基因（Rb1）缺失、失活等异常的关系。方法：用逆转录病毒载体pDOR与全长4．7kb野生型Rb1cDNA构建逆转录病毒表达载体pDOR－Rb1+。用脂质体介导法将pDOR－Rb1+转入CRIP包装细胞系。结果：实验产生了0．5X105Cfu具有一次感染能力的重组逆转病毒。利用该病毒感染SO-Rb50，经G418筛选，获得了抗G418细胞群体。运用PCR及Southern杂交技术对转染细胞进行检测，结果表明该抗G418细胞中有完整的外源Rb1存在。Northern杂交发现其Rb1mRNA表达水平有所提高。对细胞群体生长速率、软琼脂集落形成能力的测定表明，外源Rb1的表达使SO-Rb50在软琼脂中集落形成能力降低，而群体生长速率无明显影响。结论：外源Rb1对SO-Rb50恶性表型有一定影响。

视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb_(50)瘤细胞Rb基因突变动态变化研究

目的:研究SO-Rb50细胞系瘤细胞Rb基因突变的动态变化。方法:1.用 Southern blot杂交法分析 SO-Rb50细胞系第327代瘤细胞DNA。2.用PCR-SSCP法对SO-Rb50细胞系第415代及第713代瘤细胞的Rb基因27个外显子和1个启动子逐个筛查。3.将SO-Rb50细胞系的第775代克隆出3个细胞株:MC2、MC3及MC4。用PCR-SSCP-HA法对MC2、MC3及MC4第11代细胞和MC3第138代细胞的Rb基因的27个外显子逐个筛查。结果:SO-Rb50细胞系第327代细胞DNA缺失3.5Kb、2.9Kb及1.0Kb的三条带,证明SO-Rb50细胞系瘤细胞Rb基因缺失。第415代瘤细胞Rb基因第23外显子少一条单链;第713代第25外显子发生新的突变。SO-Rb50细胞系第775代的3个克隆株MC2、MC3及MC4的第11代细胞,只有MC4第24外显子突变;而MC3第138代第24外显子突变,提示MC3经多次传代后第24外显子发生新突变。结论:SO-Rb50细胞系在长期培养传代过程中,瘤细胞的Rb基因突变有动态变化。眼科学报2001;17:111～113。

Rb基因诱导视网膜母细胞瘤移植瘤细胞凋亡的实验研究

目的观察外源性Ｒｂ基因对视网膜母细胞瘤（ＲＢ）细胞凋亡的影响。方法建立裸鼠眼玻璃体腔ＲＢ移植瘤模型及构建Ｒｂ基因的逆转录病毒表达载体Ｐｂａｂｅ－Ｒｂ，用脂质体Ｄｏｓｐｅｒ介导法将Ｒｂ基因导入裸鼠ＲＢ移植瘤，采用流式细胞术（ＦＣＭ），光镜、电镜及ＴＵＮＥＬ细胞凋亡原位末端标记法进行ＲＢ细胞凋亡的检测。结果Ｒｂ基因在ＲＢ移植瘤内表达至少持续７天。ＦＣＭ检测发现在Ｒｂ基因转染后第４天，各实验组治疗眼ＲＢ中均可检测到凋亡细胞峰，凋亡细胞百分率高于对照眼；第２０天，各实验组治疗眼细胞凋亡百分率与对照眼比无差异（Ｐ＞０．０５）。透射电镜下可见到典型的早期凋亡细胞及晚期凋亡小体形成。ＴＵＮＥＬ方法可在荧光显微镜下见到发黄绿色荧光的凋亡细胞，光镜下可见到紫红色的被标记的凋亡细胞。结论Ｒｂ基因可诱导ＲＢ移植瘤细胞凋亡，这可能是Ｒｂ基因体内抗癌的又一作用机制。

miR-222通过靶向RB1促进视网膜母细胞瘤细胞生长与侵袭

背景与目的:视网膜母细胞瘤基因1(retinoblastoma 1,RB1)能够抑制多种肿瘤的发生、发展,且与细胞周期、分化、衰老、凋亡及生长抑制等调控密切相关。该研究旨在明确miR-222是否通过靶向RB1表达而促进视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭,进一步揭示miR-222促瘤作用的分子机制。方法:将miR-222(miR-222模拟物)+RB1-wt(野生型RB1的3’-非翻译区的荧光素酶报告载体)、miR-NC(无关序列对照)+RB1-wt、miR-222+RB1-mut(突变型RB1的3’-非翻译区的荧光素酶报告载体)及miR-NC+RB1-mut共转染人视网膜母细胞瘤细胞株Y79,并采用单光子检测荧光素酶活性。采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测RB1表达水平的改变。将miR-222与miR-NC、RB1(pc DNA3.1-RB1)与vector(pc DNA3.1)、miR-222+RB1及miR-NC+vector转染Y79细胞,MTS检测细胞生长增殖活性,Transwell侵袭实验检测Y79细胞生长与侵袭能力的影响。结果:与miR-NC+RB1-wt组比较,共转染miR-222+RB1-wt组的荧光素酶活性强度降低了约56.67%(P<0.05)。与miR-NC比较,miR-222组RB1蛋白水平显著下调(P<0.05)。转染miR-222组细胞生长速度显著高于miR-NC组(P<0.05)。与pc DNA3.1组比,pc DNA3.1-RB1组可显著抑制Y79细胞的生长(P<0.05),而miR-222+pc DNA3.1-RB1组和miR-NC+pc DNA3.1组比较,细胞生长速度差异无统计学意义(P>0.05)。转染miR-222组穿过基底膜的细胞数分别为(193±10),与对照组(144±11)比较能明显加快Y79细胞的穿膜能力,差异有统计学意义(P<0.05)。而miR-NC+pc DNA3.1组和miR-222+pc DNA3.1-RB1组比较,穿过基底膜的细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。结论:miR-222通过靶向调控RB1表达而促进视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭。

视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb_(44)抑癌基因的表达

目的检测视网膜母细胞瘤（ＲＢ）细胞系ＨＸＯＲｂ４４中抑癌基因Ｒｂ的表达状况，为进一步研究ＲＢ的发病机制，利用抑癌基因Ｒｂ进行ＲＢ的基因治疗提供实验依据。方法用ＳＰ免疫组织化学（ＩＨＣ）及流式细胞术（ＦＣＭ）间接免疫荧光法对Ｒｂ基因的表达进行定性、形态学定位及定量检测。结果ＩＨＣ法检测显示：正常视网膜组织中Ｒｂ蛋白呈阳性反应，位于细胞核呈棕黄色；ＨＸＯＲｂ４４中Ｒｂ蛋白表达阴性。ＦＣＭ检测显示：正常人淋巴细胞Ｒｂ蛋白表达量是ＨＸＯＲｂ４４细胞的３．７１倍，ＨＸＯＲｂ４４中Ｒｂ蛋白表达量极低。结论ＲＢ细胞系ＨＸＯＲｂ４４中存在野生型Ｒｂ基因的功能失活，Ｒｂ基因的突变失活与ＲＢ的发生密切相关。

Cyclin D1、p16及Rb在视网膜母细胞瘤中的表达及其相关性

目的探讨Cyclin D1、p16、Rb在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中的表达及其生物学意义。方法采用免疫组织化学方法(SP法)检测Cyclin D1、p16及Rb在46例常规石蜡包埋的视网膜母细胞瘤标本中的表达,并在生物学行为及分化程度不同的视网膜母细胞瘤之间进行比较。结果正常视网膜组织与视网膜母细胞瘤组织中CyclinD1、p16及Rb蛋白表达差异有极显著性意义(P<0.01);视网膜母细胞瘤中,Rb与p16、Cyclin D1表达之间无明显相关性(P>0.05);p16表达率在生物学行为不同的视网膜母细胞瘤之间差异显著,30例视神经未浸润组视网膜母细胞瘤的p16阳性表达率明显高于16例视神经浸润组(P<0.05);Rb及p16蛋白表达阳性率随组织学分级降低而下降,分化组与未分化组视网膜母细胞瘤中Rb及p16蛋白表达率差异有极显著性意义(P<0.01)。结论p16、Rb、Cyclin D1在视网膜母细胞瘤发生发展中起着重要作用。Cyclin D1的过表达与p16和Rb的表达缺失或失活是视网膜母细胞瘤发生的重要分子事件,p16蛋白失表达可能与其视神经浸润能力有关,Rb及p16蛋白失表达则与其分化程度相关。

Rb1基因在双眼视网膜母细胞瘤病人体细胞中杂合性突变的检测

目的对５０例眼视网膜母细胞瘤（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ，ＲＢ）病人进行外周血体细胞Ｒｂ１基因杂合性突变的检测工作。方法ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（单链构像多态分析）直接测序技术。结果改进的方法可以检测出Ｒｂ１基因１～１０个碱基的多种类型的微小突变。结论可将此快速、敏感、有效的方法用于阐明Ｒｂ１基因突变机制并可以对此类病人及家系在分子水平上进行ＲＢ的产前诊断、产后早期诊断及遗传咨询。

CircAKT3对视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50增殖和凋亡的影响

目的:探讨CircAKT3对视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50增殖和凋亡的作用及生物学行为的影响。方法:采用qRT-PCR检测视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50和视网膜上皮细胞细胞系ARPE-19中CircAKT3的表达水平。后续将SO-Rb50细胞分为两组,实验组细胞转染CircAKT3 SiRNA,而对照组转染SiRNA对照序列。采用qRT-PCR检测细胞的转染效率,采用CCK-8实验检测两组细胞的增殖能力,采用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率。结果:相较于ARPE-19细胞,SO-Rb50细胞内CircAKT3的表达水平明显增高(P<0.01)。实验组在转染CircAKT3 SiRNA 24 h后,细胞内CircAKT3的表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。CCK-8实验结果显示,实验组在24、48 h的OD值和对照组无统计学差异,而在72、96 h的OD值明显低于对照组(P<0.05)。流式细胞仪结果显示,实验组和对照组的凋亡率分别为(7.71±0.396)%和(3.51±0.478)%,实验组凋亡率明显高于对照组(P<0.001)。结论:CircAKT3可促进SO-Rb50细胞的增殖和抑制细胞凋亡。

曲古菌素A对视网膜母细胞瘤Hxo-rb44细胞凋亡及Sur-vivin、c-Myc表达的影响

目的探讨曲古菌素A(TSA)对人视网膜母细胞瘤(Rb)细胞株Hxo-rb44细胞凋亡和Survivin、c-Myc表达的影响。方法将人Rb细胞株Hxo-rb44进行培养传代,流式细胞仪检测不同浓度的TSA作用不同时间对Hxo-rb44细胞周期和凋亡的影响,用Westernblot法检测凋亡过程中Survivin和c-Myc蛋白表达的变化。结果TSA可明显诱导细胞发生G2期阻滞及细胞凋亡,而且与药物作用时间呈依赖关系(r=0.97,P=0.02);Westernblot法可以观察到Survivin和c-Myc的表达水平随着TSA作用时间的延长而下降(P均<0.01)。结论TSA可以有效诱导人Rb细胞株Hxo-rb44细胞周期阻滞和凋亡,其作用机制与抑制Survivin和c-Myc表达有关。

视网膜母细胞瘤基因（Rb基因）的作用机制

Ｒｂ基因是与视网膜母细胞瘤发生有关的基因，是人类克隆成功的第一个抗癌基固。Ｒｂ基因具有抑制肿瘤细胞的生长及肿瘤性的抗癌作用。Ｒｂ基因的这种抗癌性主要与Ｒｂ蛋白的蛋白结合功能、Ｒｂ蛋白对多种与细胞增值有关的基因转录的影响，以及由此导致的细胞周期在Ｇ１期停滞有关。Ｒｂ基因的功能还受到各种细胞机制的调节，特别是Ｒｂ蛋白细胞周期性的磷酸化和脱磷酸化对Ｒｂ蛋白功能的调节最为重要。

Rb基因扩增与视网膜母细胞瘤发生的关系初步探讨

在对视网膜母细胞瘤病人的Rb 基因存在状态进行检测时,发现一例患者体细胞Rb 基因有明显扩增改变。Rb 基因在视网膜母细胞瘤患者中的扩增改变,为首次报导,是否意味着Rb 基因扩增与肿瘤发生有着某种关联。

母系遗传性视网膜母细胞瘤家系RB1基因分析与产前诊断

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB;OMIM180200）是一种来源于未成熟视网膜细胞的恶性罕见肿瘤,是最早发现的由基因突变而导致的肿瘤,该致病基因被命名为视网膜母细胞瘤基因1（RB1）,因此RB1也成为了第一个被成功克隆的人类抑癌基因。已有研究表明,90%的双眼和15%的单眼RB患者外周血基因组DNA中均能检测到RB1基因致病性杂合突变。

大蒜素对人视网膜母细胞瘤Rb细胞中Bcl-2表达影响的研究

目的探讨大蒜素对人视网膜母细胞瘤Rb细胞的抑制作用,及其对Bcl-2表达的影响。方法人视网膜母细胞瘤Rb细胞株,经复苏,孵育,传代分为10个实验组。分别用不同浓度大蒜素(5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml)、顺铂(3μg/ml)及大蒜素(15μg/ml)和顺铂(3μg/ml)联合处理人视网膜母细胞瘤Rb细胞,在不同时间(24h、48h、72h)观察Rb细胞的形态,并应用免疫细胞化学SP法检测不同处理条件下和各时间点Bcl-2的表达情况。结果人视网膜母细胞瘤Rb细胞在不同浓度大蒜素、顺铂以及大蒜素和顺铂联合作用下,细胞生长增殖受到抑制,与大蒜素空白液、培养液对照组的Rb细胞相比形态学变化明显。不同浓度的大蒜素均可以下调人视网膜母细胞瘤Rb细胞中Bcl-2的表达,大蒜素作用组与对照组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。大蒜素下调Bcl-2的表达具有时间和剂量依赖性,随着大蒜素作用时间的延长,Bcl-2的表达依次下降。大蒜素(15μg/ml)和顺铂(3μg/ml)联合用药可增强对人视网膜母细胞瘤Rb细胞的生长抑制,与大蒜素(15μg/ml)、顺铂(3μg/ml)单独处理Rb细胞比较,下调Bcl-2的表达作用具有显著性差异(P<0.05)。结论人视网膜母细胞瘤Rb细胞中存在与细胞凋亡有关的Bcl-2蛋白低表达。大蒜素可抑制人视网膜母细胞瘤Rb细胞的生长,且抑制作用随药物作用浓度的增高和作用时间的延长而增强,具有时间和浓度依赖性。采用免疫细胞化学的方法检测人视网膜母细胞瘤Rb细胞中Bcl-2的表达,发现大蒜素作用组Bcl-2的表达较空白和溶剂对照组低,提示大蒜素抑制人视网膜母细胞瘤Rb细胞的生长与Bcl-2介导的细胞凋亡有关,大蒜素和顺铂联合用药作用强于单独用药,可进一步提高药物对肿瘤细胞的生长抑制。

甲基莲心碱对长春新碱人抗视网膜母细胞瘤细胞作用的影响及与RB蛋白表达的关系

目的：探讨甲基莲心碱对长春新碱（Vincnstine,VCR)抗人视网膜母细胞（Retinoblastoma,RB)作用的影响及与RB蛋白表达的关系。方法：甲氮甲唑蓝（MTT）法检测药物对肿瘤细胞增殖的影响，流式细胞仪检测RB蛋白的表达，PI染色流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡，结果：（1）5、10umol/L Nef能降低VCR抑制Rb细胞的IC50，（2）5、10umol/L Nef能促进VCR诱导Rb细胞凋亡，（3)10umol/L能促进Rb细胞的RB蛋白的表达，（4）Nef能促进Rb细胞G1阻断。结论：（1）Nef能增加VCR抑制Rb细胞增殖，促进VCR诱导Rb细胞凋亡，具有较好的化疗增敏作用，（2）Net通过促进Rb细胞Rb蛋白的表达和Rb细胞G1阻断，而实现对视网膜母细胞瘤的化疗增敏作用。

国人视网膜母细胞瘤患者RB1基因突变的特性

目的:检测国人RB患者体细胞中RB1基因突变,分析我国RB1基因突变的特性,探讨RB1基因突变的分子生物学机制。方法:应用PCR—SSCP技术筛查28例RB患者及亲属的白细胞基因组DNA,测序分析确定突变。结果:共确定7例RB1基因生殖细胞性突变。结论:本组RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失,这些突变改变了RB1基因的遗传信息,致使异常的RB1基因蛋白产生,导致视网膜母细胞瘤的发生。中国RB1基因突变方式主要是以微小突变为主,但复杂突变的比例相对较高。