蓝莓花青素调控Notch1/Hes-1通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的影响及机制研究

目的探讨蓝莓花青素(BA)对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)氧化损伤的影响及可能的作用机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组(NC组,n=10)和造模组,造模组一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg,构建糖尿病模型,造模成功后再随机分为糖尿病模型组(DM组)、蓝莓花青素组(BA组)、DAPT组(Notch1通路抑制剂)和蓝莓花青素+DAPT组(BA+DAPT组),每组10只。BA组每天给予20 mg/kg的BA灌胃,DAPT组给予10μmol/L的DAPT干预,BA+DAPT组给予20 mg/kg的BA灌胃+10μmol/L的DAPT干预,NC组和DM组用等量0.9%氯化钠溶液(生理盐水)灌胃,连续8周。于末次给药24 h后,摘取大鼠眼球,用酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒检测各组大鼠视网膜组织中活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠视网膜组织病理变化,并进行RGC计数;用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量HO-1和iNOS mRNA表达;Western blot法检测Notch1和Hes-1蛋白的表达。结果建模后,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组空腹血糖(FBG)值均大于16.7 mmol/L;经BA干预治疗后,BA组和BA+DAPT组FBG含量明显降低,BA组低于BA+DAPT组(P<0.05)。ELISA结果表明,与NC组比较,DM组视网膜组织中ROS和MDA含量升高,CAT和SOD含量降低(P<0.05);与DM组比较,BA组和BA+DAPT组视网膜组织中ROS和MDA水平下降,CAT和SOD水平显著上升(P<0.05)。光学显微镜观察显示,NC组视网膜结构清晰,细胞形态正常,排列整齐;DM组大鼠RGC层排列紊乱,内、外核层伴随有水肿,出现了空泡现象,视网膜厚度变薄;BA组大鼠视网膜层结构排列较整齐,水肿程度和视网膜厚度较DM组有一定的改善;BA+DAPT组大鼠视网膜组织较DM组有所改善,但视网膜厚度相比BA组还是较薄。RGC计数结果显示,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组RGC数量分别为7.35±1.28、12.05±1.52、5.61±1.72、8.72±1.19,明显低于NC组的16.63±1.54,组间差异有统计学意义(F=88.905,P<0.05)。qRT-PCR结果表明,NC组、DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组大鼠视网膜组织中HO-1水平分别为1.28±0.32、0.68±0.15、1.03±0.19、0.50±0.13和0.73±0.11,iNOS水平分别为0.48±0.08、1.17±0.21、0.89±0.17、1.35±0.15和1.10±0.23,差异均有统计学意义(F=25.192、35.843,P<0.05)。Western blot结果显示,与NC组相比,DM组视网膜组织中Notch1和Hes-1蛋白表达均下调;与DM组比较,BA组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均上调,DAPT组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均下调,BA+DAPT组两蛋白表达低于BA组,组间差异有统计学意义(F=47.626、54.709,P<0.05)。结论BA可以降低糖尿病大鼠FBG,增强其抗氧化应激能力,改善视网膜组织病理学损伤,从而对神经节细胞起到保护作用,其作用机制可能与激活Notch1/Hes-1信号通路有关。

中医药调控缺血缺氧微环境对青光眼治疗及视网膜神经节细胞凋亡的研究进展

青光眼是首位不可逆性致盲眼病,严重威胁人类视觉健康。当前常规治疗方法是使用眼药水、手术等方式以降低眼内压,但是临床长期疗效差强人意。青光眼最主要的病理基础为神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)退行性改变及凋亡,临床及实验研究发现缺血缺氧微环境的改变常常会加重RGCs的凋亡,而如何延缓甚至抑制其凋亡是当前研究的热点。气血理论是中医核心概念之一,中医药具有多组分、多途径、多靶标的作用特点,对于复杂病理机制所导致的视网膜缺血缺氧微环境改变具有独特的治疗优势和潜力。随着近年来中医药研究的不断发展,中药在保护RGCs方面取得了不少新的研究。该文就中药有效活性成分和复方制剂在保护RGCs的有效性及潜在机制方面进行了总结,以期为临床工作中更有效地抑制RGCs凋亡、改善视功能提供一定的借鉴意义。

藏红花素通过跨膜受体蛋白/发状分裂相关增强子1信号通路对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的探讨藏红花素对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的作用及其可能机制。方法于2021年1月至2022年1月采用不同浓度藏红花素处理视网膜神经节细胞RGC-5,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并用氯化钴(CoCl_(2))处理建立缺氧模型,分为缺氧组、藏红花素组、阳性对照(抗坏血酸)组和藏红花素+跨膜受体蛋白信号通路抑制剂(DAPT)组,另设对照组。Cell counting kit-8法检测细胞存活情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;钙荧光探针(Flou-4)实验检测各组细胞钙离子水平;实时定量PCR法检测跨膜受体蛋白(Notch1)、发状分裂相关增强子1(Hes-1)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、钙依赖性蛋白酶家族1(Cal⁃pain1)蛋白表达情况。结果藏红花素组细胞活力0.83±0.08高于缺氧组0.45±0.04,细胞凋亡率(17.92±1.21)%低于缺氧组(51.82±5.36)%,钙离子水平0.27±0.04低于缺氧组0.76±0.05,差异有统计学意义(P<0.05);藏红花素+DAPT组细胞活力0.50±0.06低于藏红花素组0.83±0.08,细胞凋亡率(36.50±3.50)%高于藏红花素组(17.92±1.21)%,钙离子水平0.65±0.05高于藏红花素组0.27±0.04,差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧组比较,藏红花素组Bcl-2蛋白表达水平升高,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与藏红花素组比较,藏红花素+DAPT组Bcl-2蛋白表达水平降低,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论藏红花素对体外培养的缺氧RGC-5细胞凋亡有一定的抑制作用,可能是通过抑制钙离子内流,阻滞Notch1/Hes-1通路,提高细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平发挥作用。

汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究

目的观察汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用,并探究其相关作用机制。方法10只(10眼)C57BL/6J小鼠作为对照组;40只(40眼)DBA/2J小鼠用于制备青光眼模型,并分为模型组和实验1、2、3组,每组各10只。对照组、模型组小鼠灌胃生理盐水,实验1、2、3组小鼠分别灌胃50、100、150 mg·kg^(-1)汉黄芩素。以小鼠右眼为入选眼,比较各组小鼠灌胃前和灌胃2周、4周、8周眼压;苏木素-伊红染色并比较各组小鼠RGC数量、视网膜厚度;比色法检测各组小鼠视网膜组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)水平;酶联免疫吸附法检测各组小鼠视网膜组织白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot检测各组小鼠视网膜组织核苷酸寡聚化结构域样受体家族3(NLRP3)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白表达水平。结果灌胃前,与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。灌胃2周、4周、8周:与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均降低,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与实验1组相比,实验2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论汉黄芩素可改善青光眼小鼠视网膜厚度,缓解视网膜组织氧化损伤和炎症反应,其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体激活有关。

小鼠视网膜神经节细胞在视神经损伤后的基因表达谱分析

目的:揭示小鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的分子机制和潜在的治疗靶点。方法:构建视神经损伤(ONC)小鼠模型,对视网膜组织进行HE染色观察组织病理学改变,并使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RGCs标志物—具有多重剪接的RNA结合蛋白(Rbpms)的mRNA表达水平;透射电镜(TEM)观察RGCs线粒体损伤情况;采用转录组测序分析ONC 7 d组小鼠的视网膜差异表达基因,并对差异表达基因进行Gene Ontology(GO)功能、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集和韦恩分析,RT-qPCR检测差异基因mRNA表达水平。结果:与正常组相比,ONC 7 d组RGCs数量显著减少,细胞排列疏松不规则,RGCs标志物Rbpms的mRNA表达水平显著降低(P<0.001),ONC小鼠模型构建成功。透射电镜结果表明,ONC 7 d组RGCs的线粒体出现肿胀,嵴消失;转录组测序结果表明,ONC 7 d组与正常组比,存在562个差异表达基因,其中152个基因表达下调和410个基因表达上调。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析表明ONC后差异表达基因主要富集于神经元损伤修复的多个重要信号通路;RT-qPCR结果显示,与正常组相比,与神经元损伤修复相关的基因Ecel1、Atf3、Sprr1a的表达均在损伤后第4天显著上调(均P<0.05),与测序结果一致。结论:ONC小鼠RGCs凋亡与线粒体损伤有关,而神经元损伤修复相关基因Atf3、Ecel1、Sprr1a在视神经损伤的早期参与了小鼠视神经损伤后RGCs的保护。

当归多糖通过Akt/GSK-3β通路增强Nrf2信号传导对高糖诱导视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨当归多糖对高糖诱导的视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用及其可能机制。方法:采用不同浓度当归多糖干预视网膜神经节细胞RGC-5,MTT法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并添加50 mmol/L葡萄糖建立高糖损伤模型后,分为高糖组、当归多糖组和当归多糖+Nrf2信号通路抑制剂(ML385)组,另设对照组。当归多糖组使用100μmol/L的当归多糖处理,当归多糖+ML385组使用100μmol/L的当归多糖联合20μmol/L的ML385处理,高糖组使用50 mmol/L葡萄糖处理,对照组加入等量完全培养基。CCK-8法检测细胞存活情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测各组细胞中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物岐化酶(SOD)含量;实时定量PCR法检测细胞中蛋白激酶B(Akt)mRNA、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)mRNA和核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA表达情况;Western blotting检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达情况。结果:当归多糖组细胞活力、GSH-Px含量、SOD含量、Nrf2 mRNA相对表达量、Bcl-2蛋白相对表达量均高于高糖组,细胞凋亡率、MDA含量、Akt mRNA相对表达量、GSK-3βmRNA相对表达量、Bax蛋白相对表达量、Caspase-3蛋白相对表达量、Caspase-9蛋白相对表达量均低于高糖组(P<0.05)。当归多糖+ML385组细胞活力、GSH-Px含量、SOD含量、Nrf2 mRNA相对表达量、Bcl-2蛋白相对表达量均低于当归多糖组,细胞凋亡率、MDA含量、Akt mRNA相对表达量、GSK-3βmRNA相对表达量、Bax蛋白相对表达量、Caspase-3蛋白相对表达量、Caspase-9蛋白相对表达量均高于当归多糖组(P<0.05)。结论:当归多糖能抑制高糖诱导的RGC-5细胞凋亡,降低细胞内氧化应激水平,可能机制为通过阻滞Akt/GSK-3β通路,提高细胞内抗氧化Nrf2表达水平。

SSTF上调miR-495表达减缓高糖诱导的视网膜神经节细胞氧化损伤和凋亡

目的探讨黄岑茎叶总黄酮(SSTF)对高糖诱导的视网膜神经节细胞(RGC-5)损伤的保护机制。方法根据处理方法不同将RGC-5细胞分成高糖(HG)组、对照(Con)组、HG+SSTF-低剂量(L)组、HG+SSTF-中剂量(M)组、HG+SSTF-高剂量(H)组、HG+miR-NC组、HG+miR-495组、HG+SSTF+anti-miR-NC组、HG+SSTF+anti-miR-495组,每组设置9复孔。检测MDA含量以及CAT、SOD活性。流式细胞术检测细胞凋亡。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-495表达。结果HG组RGC-5细胞凋亡率、MDA含量高于Con组(P<0.05),CAT、SOD的活性、miR-495表达低于Con组(P<0.05)。HG+SSTF-L组、HG+SSTF-M组、HG+SSTF-H组RGC-5细胞凋亡率、MDA含量低于HG组(P<0.05),CAT和SOD的活性、miR-495表达高于HG组(P<0.05)。HG+miR-495组RGC-5细胞凋亡率[(14.96±1.26)%]、MDA含量[(4.62±0.44)μmol/g]分别低于HG+miR-NC组[(33.28±2.25)%、(9.73±0.81)μmol/g],差异有统计学意义(P<0.05),CAT、SOD的活性、miR-495表达水平高于HG+miR-NC组(P<0.05)。HG+SSTF+anti-miR-495组RGC-5细胞凋亡率[(22.21±2.18%)]、MDA含量[(8.07±0.75)μmol/g]高于HG+SSTF+anti-miR-NC组[(9.19±0.84)%、(3.59±0.32)μmol/g],差异有统计学意义(P<0.05),CAT和SOD的活性、miR-495表达水平低于HG+SSTF+anti-miR-NC组(P<0.05)。结论SSTF通过上调miR-495表达减缓高糖诱导的视网膜神经节细胞氧化损伤和凋亡。

内在光敏性视网膜神经节细胞研究现状与展望

内在光敏性视网膜神经节细胞(ipRGC)是近20a来新发现的一类感光细胞。它们通过视色素黑视蛋白发挥感光功能,并将光信号传递至非成像功能脑区如视交叉上核(SCN)、橄榄前盖核(OPN)以控制昼夜节律光夹带和瞳孔对光反射;还有少部分信号投射至大脑成像区域如背外侧膝状核(dLGN)和上丘(SC)参与成像视觉。目前已发现6种ipRGC亚型(M1~M6),每种亚型都具有独特的形态和生理特性。这些细胞除了接收来自视杆细胞和视锥细胞的信号输入,也在视网膜内部通过化学突触和电突触调节视网膜内信号转导,在视觉信号传递和视觉发育中发挥重要作用。研究发现ipRGC与多种眼科及全身性疾病存在重要联系。由此可见这是一类复杂且重要的细胞类型,本文从ipRGC的发现、一般生理特性、信号转导和与疾病的关系等多方面进行综述。

当归多糖通过调控miR-148a-3p抑制高糖诱导的视网膜神经节细胞氧化应激损伤及凋亡研究

目的观察当归多糖对高糖诱导的视网膜神经节细胞(RGC)氧化应激损伤及凋亡的影响,并探讨可能机制。方法取对数期RGC-5细胞,分为对照组(常规培养基培养)、高糖组(含葡萄糖30 mmol/L的培养基培养)及高糖+低、中、高剂量组(分别用含葡萄糖30 mmol/L与当归多糖100、200、400 mg/L的培养基培养)。另取对数期RGC-5细胞,将细胞分为高糖+mi R-NC组、高糖+mi R-148a-3p mimics组、高糖+mi R-148a-3p inhibitor组、高糖+当归多糖+mi R-148a-3p mimics组、高糖+当归多糖+mi R-148a-3p inhibitor组。ELISA法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平;Annexin V/PITC双染法检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达量。结果与对照组比较,高糖组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量降低,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量升高(P<0.05);与高糖组比较,高糖+低剂量组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05);与高糖+低剂量组比较,高糖+中剂量组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05);与高糖+中剂量组比较,高糖+高剂量组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05)。与高糖+mi R-NC组比较,高糖+mi R-148a-3p mimics组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05),高糖+mi R-148a-3p inhibitor组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量降低,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量升高(P<0.05);与高糖+mi R-148a-3p mimics组比较,高糖+当归多糖+mi R-148a-3p mimics组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05);与高糖+mi R-148a-3p inhibitor组比较,高糖+当归多糖+mi R-148a-3p inhibitor组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05)。结论当归多糖可减轻高糖诱导的RGC氧化应激损伤,减少细胞凋亡,且表现为剂量依赖性,其作用机制可能与上调mi R-148a-3p表达有关。

通窍明目汤通过p53/AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬改善青光眼视网膜神经节细胞损伤的机制研究

目的观察通窍明目汤对青光眼视网膜神经节细胞(RGC)氧化应激损伤的作用机制及其对p53/AMPK/mTOR通路所介导的RGC自噬的影响。方法采用CCK-8法检测RGC增殖率,流式细胞术检测RGC凋亡率,免疫荧光检测RGC内活性氧(ROS)表达,ELISA法检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量及活性,Western blot检测RGC中Beclin-1、p62表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p53/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组RGC增殖率下降,RGC凋亡率升高;ROS阳性细胞数量增加,SOD活性、MDA和GSH-PX含量升高,模型组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、细胞核p53、p-AMPK及mTORC1表达升高,p62、细胞质p53、AMPK及p-mTORC1蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,各浓度通窍明目汤组RGC增殖率升高,RGC凋亡率下降;RGC中ROS阳性细胞数量减少;SOD活性,MDA和GSH-PX含量降低,与模型组相比,各剂量通窍明目汤组及PFT-ɑ组细胞p62、细胞质p53、AMPK及p-mTORC1蛋白表达升高,Beclin1表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、细胞核p53、p-AMPK及mTORC1表达降低(P<0.05)。结论通窍明目汤可通过介导p53/AMPK/mTOR信号通路上调RGC自噬水平,从而抑制青光眼视神经萎缩的进展。

硫化氢通过激活ATP敏感性钾通道保护小鼠在体缺血损伤视网膜和原代缺氧视网膜神经节细胞

目的:研究硫化氢(H_2S)是否能够通过激活ATP敏感性钾通道(K_(ATP)通道)减轻小鼠原代缺氧视网膜神经节细胞及在体缺血视网膜损伤。方法:(1)培养分离纯化的小鼠原代视网膜神经节细胞(RGCs),给予缺氧处理或缺氧+硫氢化钠(NaHS)处理,利用Hoechst 33258染色和ELISA测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)浓度观察细胞死亡率变化;给予K_(ATP)通道激动剂或阻断剂,利用膜片钳、Western blot和钙成像技术观察硫化氢是否通过K_(ATP)通道减轻缺氧导致的细胞损伤;(2)在体建立小鼠视网膜缺血模型,模型动物分为5组(每组8只小鼠),分别为溶剂对照组、NaHS组、NaHS+K_(ATP)通道阻断剂组、K_(ATP)通道激动剂组和K_(ATP)通道激动剂+K_(ATP)通道断剂组,组织学切片观察视网膜各层厚度及RGCs层细胞密度变化。结果:(1)与氧糖剥夺(OGD)组相比,100μmol/L和300μmol/L NaHS可以显著减轻缺氧导致的原代RGCs细胞死亡率(P<0.01),同时也减少LDH释放量(1.5±0.3和1.3±0.2, P<0.01);与OGD组相比,NaHS和K_(ATP)通道激动剂可使细胞显著超极化(P<0.05, n=26),诱发放电显著减少(P<0.01, n=29),显著减少钙内流(P<0.01, n=14)和cleaved caspase-3表达量(P<0.05, n=7),显著减轻氧糖剥夺导致的原代RGCs损伤;而K_(ATP)通道阻断剂使细胞去极化,诱发放电增多,增加钙离子内流和cleaved caspase-3表达,逆转了这种保护作用;(2)在体实验中,给予NaHS或K_(ATP)通道激动剂可以显著逆转缺血损伤导致的视网膜厚度降低(P<0.05,n=8);与缺血组比较,RGCs层细胞密度也显著增高(P<0.05, n=8),而K_(ATP)通道阻断剂能够抑制这种保护作用。结论:NaHS可通过激活K_(ATP)通道减轻原代缺氧小鼠RGCs和小鼠在体缺血视网膜导致的损伤。

基于PI3K/AKT通路探讨青光增视方对过氧化氢诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护机制

目的探讨青光增视方对过氧化氢(H2O2)诱导的视网膜神经节细胞(RGC)-5损伤的保护作用及其对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路的调节作用。方法通过H2O2诱导体外培养的RGC-5建立氧化应激损伤细胞模型,用空白血清(模型组)、甲钴胺含药血清(西药组)、青光增视方高、中、低剂量含药血清(青光增视方组)处理模型细胞。采用CCK-8法检测RGC-5的存活率,流式细胞术检测RGC-5的凋亡情况,采用定量PCR及Western blotting检测RGC-5的PI3K、AKT、PTEN、eNOS mRNA及蛋白的表达情况。结果与空白组比较,各组RGC-5存活率降低,模型组PI3K、eNOS mRNA与PI3K、p-AKT/AKT、eNOS蛋白表达水平降低,PTEN mRNA及蛋白表达升高;与模型组比较,西药组、青光增视方高、中剂量组RGC-5存活率增加,西药组、青光增视方高剂量组PI3K、eNOS mRNA及中剂量组的eNOS mRNA表达升高,各给药组PTEN mRNA及蛋白表达降低,PI3K、p-AKT/AKT、eNOS蛋白表达升高;与西药组比较,青光增视方低、中剂量组PTEN mRNA表达升高,eNOS mRNA降低(P<0.05),高剂量组PI3K、p-AKT/AKT及中剂量组p-AKT/AKT蛋白升高,青光增视方高、中剂量组PTEN蛋白降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论青光增视方对H2O2诱导的RGC损伤具有保护作用,其机制可能与调控PI3K、AKT、PTEN、eNOS的表达有关。

齐墩果酸对糖尿病大鼠视网膜氧化应激反应和视网膜神经节细胞损伤的影响

目的 探讨齐墩果酸对糖尿病大鼠视网膜氧化应激反应和视网膜神经节细胞(RGC)损伤的影响。方法 取6周龄健康清洁级雄性SD大鼠30只,将大鼠随机分为对照组、糖尿病组和齐墩果酸组,每组10只。对照组大鼠给予鼠维持饲料喂养,糖尿病组和齐墩果酸组给予高脂饲料喂养。4周后,按照35 mg·kg^(-1)的剂量给予糖尿病组和齐墩果酸组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,对照组注射相应体积的柠檬酸钠缓冲液。次日尾静脉采血,大鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L^(-1)说明造模成功。剔除2只造模失败的大鼠,最终对照组10只大鼠,糖尿病组9只,齐墩果酸组9只。齐墩果酸组大鼠每天给予100 mg·kg^(-1)齐墩果酸灌胃,对照组及糖尿病组每天给予等量的溶剂灌胃。干预8周后处死大鼠,摘取双侧眼球。分离大鼠左眼视网膜,检测大鼠视网膜组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。将大鼠右侧眼球固定后,石蜡包埋、切片,HE染色观察视网膜组织形态,免疫组织化学染色计算RGC密度并检测核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)及血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达情况。结果 糖尿病组大鼠视网膜组织SOD活性低于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织SOD活性高于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。糖尿病组大鼠视网膜组织MDA含量高于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织MDA含量低于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜变薄,结构疏松,内核层和外核层细胞排列紊乱,外丛状层连续性差;与糖尿病组相比,齐墩果酸组大鼠视网膜结构较清晰,细胞排列较整齐。糖尿病组大鼠视网膜组织RGC密度小于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织RGC密度大于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。糖尿病组大鼠视网膜组织Nrf2及HO-1染色阳性的平均光密度均高于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织Nrf2及HO-1染色阳性的平均光密度均高于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 齐墩果酸可能通过调控Nrf2/HO-1通路来减轻糖尿病大鼠视网膜氧化应激反应和RGC损伤。

姜黄素对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响及机制

目的:探讨姜黄素对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响及机制。方法:将21只SD大鼠随机分为3组,每组7只,高眼压模型组和姜黄素治疗组大鼠通过烧灼巩膜上静脉法建立慢性高眼压模型,假手术组大鼠仅剪开球结膜,不烧灼巩膜上静脉;姜黄素治疗组给予4mL/kg姜黄素灌胃,假手术组和高眼压模型组给予4mL/kg纯水灌胃,连续3wk。造模后3wk,采用HE染色观察各组大鼠视网膜组织形态病理变化、RGCs数量及神经节细胞层(GCL)厚度;采用TUNEL染色观察各组大鼠RGCs和视网膜细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色和Western blot法检测各组大鼠视网膜谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)与血红素加氧酶-1(HO-1)的表达水平。结果:与假手术组相比,高眼压模型组和姜黄素治疗组大鼠视网膜组织形态紊乱,RGCs数量减少,GCL变薄,RGCs和视网膜细胞凋亡率均升高,GCLM和HO-1表达量均升高;与高眼压模型组相比,姜黄素治疗组大鼠视网膜组织形态基本正常,RGCs数量增多,GCL增厚,RGCs和视网膜细胞凋亡率均降低,GCLM和HO-1表达量均升高。结论:姜黄素在慢性高眼压大鼠模型中可通过上调抗氧化基因GCLM与HO-1的表达抑制RGCs凋亡。

衰老在视网膜神经节细胞损伤中的作用及意义

衰老是一个导致体内组织和细胞功能减退及异常的退变过程。在衰老引起的视神经退行性病变中,损伤主要发生于视网膜神经节细胞(RGCs)。通过引起能量生成障碍、氧化应激损伤、线粒体突变积累、蛋白质错误折叠积累、免疫炎症反应、神经营养因子缺乏、血流灌注不足、跨筛板压力差升高和筛板结缔组织硬化等改变,衰老增加RGCs对损伤因子的易感性,在视神经损伤及变性过程中发挥重要作用。RGCs年轻化是治疗青光眼等神经退行性疾病的关键,可以减弱,甚至逆转衰老对其造成的损害,促进RGCs的再生,为视功能保护提供了新的靶点。因此,衰老致RGCs损伤机制的研究将为神经退行性疾病的早期诊断和治疗带来新的思路。本文从衰老与RGCs损伤和RGCs年轻化的新思路2个方面就衰老在RGCs损伤中的作用及意义进行综述。

miR-1298通过调控SetD7表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长

目的探索miR-1298调控青光眼视网膜神经节细胞生长及其机制。方法20只C57BL/6小鼠被用于阻断巩膜上静脉建立慢性小鼠青光眼模型。脂多糖诱导Müller细胞作为体外模型,同时转染miR-NC(空白对照组)、miR-1298 mimic、miR-1298 inhibitor、miR-1298 mimic+重组人Set7/9组蛋白甲基转移酶(SetD7)。采用MTT实验、乳酸脱氢酶(LDH)活性和Caspase-3、Caspase-9试剂盒、RT-qPCR和Western blot方法探索miR-1298的功能和机制。结果在青光眼小鼠模型视网膜组织中miR-1298表达量显著提高。上调miR-1298能够抑制Müller细胞增殖和激活LDH活性,下调miR-1298能够促进Müller细胞增殖和减少LDH活性。SetD7是miR-1298调控靶点,激活SetD7可以减弱miR-1298对青光眼视网膜神经节细胞生长的抑制作用。结论miR-1298在青光眼小鼠模型视网膜组织中表达量显著提高,miR-1298能够通过调控SetD7表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长,miR-1298的表达可为青光眼预防和治疗提供参考。

基于信号通路的中药保护青光眼视网膜神经节细胞药理机制研究进展

青光眼是不可逆性致盲性眼病,视神经萎缩是其特征性表现,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的凋亡是青光眼视神经萎缩的病理基础。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路作为一条促存活通路,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等活动,活络效灵丹等中药可通过靶向PI3K/Akt通路上凋亡信号分子抑制RGCs凋亡,保护视神经。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路可调节炎症、凋亡、氧化等病理活动,槲皮素等通过抑制该通路激活,减轻RGCs炎症反应及氧化应激等损伤。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是真核细胞对缺氧反应的起始转录因子,过量的HIF-1会促发凋亡和新生血管产生。疏肝通窍方等可通过抑制HIF-1的表达,提高RGCs存活率。Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)信号通路参与调节细胞骨架重组,改变小梁细胞结构,影响房水排出。青光安Ⅱ号方等具有抑制ROCK通路活化功能,可降低眼压,延缓青光眼进展。Wnt/β-catenin信号通路是细胞生长、组织重塑和器官形成的重要途径,可导致多种神经退行性疾病发生,中药复方活血方通过下调该通路相关因子可减轻RGCs丢失。本文总结了中药干预青光眼RGCs凋亡的关键基因和信号通路,寻找相关信号通路的靶向激动剂或阻断剂,以期更好指导临床和后续研究。

高良姜素对青光眼大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的研究高良姜素对青光眼大鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用。方法取48只SD大鼠随机分为对照组、对照+高良姜素组、高眼压组和高眼压+高良姜素组,每组12只(12眼)。对照+高良姜素组和高眼压+高良姜素组大鼠接受高良姜素滴眼液治疗,对照组和高眼压组大鼠则接受相同剂量二甲基亚砜溶剂滴眼。于造模后第0~28天监测大鼠眼压,并于造模后第28天处死大鼠,收集各组大鼠右眼球,并采用HE染色观察大鼠视网膜形态变化,采用免疫组织化学染色分析各组大鼠视网膜中GFAP、Toll样受体4(TLR4)和NOD样受体3(NLRP3)表达。从4只4 d龄大鼠视网膜中分离RGC,分为空白组、光气组和CoCl 2+高良姜素组。光气组和光气+高良姜素组RGC与200μmol·L-1 CoCl 2一起孵育48 h,光气+高良姜素组RGC中加入20μmol·L-1高良姜素干预48 h。收集各组细胞,采用流式细胞术和Western blot检测RGC的凋亡率及相关蛋白的相对表达情况,并采用ELISA检测空白组、光气组和光气+高良姜素组RGC中IL-18和IL-1β蛋白表达。结果造模后第3~28天,与对照组比较,高眼压组大鼠眼压均显著升高(均为P<0.001),高眼压+高良姜素组大鼠眼压差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后第0~28天,对照组与对照+高良姜素组大鼠眼压差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后第18~28天,与高眼压组比较,高眼压+高良姜素组大鼠眼压均持续显著降低(均为P<0.05)。对照组大鼠视网膜厚度、RGC生存率与对照+高良姜素组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);与对照组比较,高眼压组大鼠视网膜厚度、RGC生存率均显著减少(均为P<0.01),高眼压+高良姜素组大鼠视网膜厚度、RGC生存率差异均无统计学意义(均为P>0.05);与高眼压组比较,高眼压+高良姜素组大鼠视网膜厚度、RGC生存率均显著增加(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,与对照组比较,高眼压组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达均显著上调(均为P<0.001),高眼压+高良姜素组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达均显著降低(均为P<0.001),对照+高良姜素组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达差异无统计学意义(均为P>0.05);与高眼压组比较,高眼压+高良姜素组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达均显著降低(均为P<0.01)。在体外实验中,与空白组比较,光气组RGC中IL-18和IL-1β表达均显著增加(均为P<0.05);与光气组比较,光气+高良姜素组RGC中IL-18和IL-1β表达均显著减少(均为P<0.001);光气组RGC中TLR4、NLRP3蛋白表达较空白组均显著增加(均为P<0.001);且光气+高良姜素组RGC中TLR4、NLRP3蛋白表达较光气组均显著减少(均为P<0.01)。结论高良姜素在青光眼模型中可降低眼压并防止RGC凋亡,其保护机制可能与抑制TLR4/NLRP3炎症小体激活有关。

调节性核糖核酸酶1对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的探讨调节性核糖核酸酶1(Reg1)对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用及机制。方法2018年8月至2020年2月构建高糖诱导的RGC-5视网膜神经节细胞损伤模型,实验分为四组:Con组(正常糖+未转染的RGC-5细胞)、HG组(高糖+未转染的RGC-5细胞)、pcDNA3-Reg1组(高糖+转染Reg1过表达质粒的RGC-5细胞)、pcDNA3-NC组(高糖+转染对照质粒的RGC-5细胞)。实时荧光定量聚合酶链式反应检测Reg1、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;蛋白质免疫印迹检测Reg1、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)的表达;免疫荧光染色检测Reg1、p-p65的表达;TUNEL染色检测凋亡水平;酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中各炎性因子的含量。结果Con组中Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为1.00±0.21、1.00±0.15、1.00±0.18,HG组Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为2.49±0.36、3.86±0.42、3.17±0.39,pcDNA3-Reg1组Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为6.77±0.72、8.18±0.67、6.30±0.51,pcDNA3-NC组Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为2.75±0.40、3.59±0.38、2.85±0.34,HG组、pcDNA3-NC组Reg1相对荧光强度、mRNA和蛋白质相对表达量高于Con组,且低于pcDNA3-Reg1组(P<0.05)。Con组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(1.73±0.22)%、1.00±0.28、1.00±0.20、1.00±0.17,HG组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(14.79±0.83)%、0.29±0.11、5.25±0.66、4.93±0.52,pcDNA3-Reg1组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(3.77±0.34)%、0.58±0.43、2.51±0.45、2.58±0.33,pcDNA3-NC组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(14.55±0.90)%、0.21±0.14、5.14±0.59、4.77±0.46,Con组、pcDNA3-Reg1组TUNEL+细胞比例、Bax、cleaved caspase-3蛋白质相对表达量低于HG组、pcDNA3-NC组,而Bcl-2蛋白质相对表达量高于HG组、pcDNA3-NC组(P<0.05)。Con组、pcDNA3-Reg1组细胞IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-αmRNA相对表达量,及上清液蛋白质含量低于HG组、pcDNA3-NC组(P<0.05)。Con组、pcDNA3-Reg1组p-p65相对荧光强度,及p-p65、p-IκBα蛋白质相对表达量低于HG组、pcDNA3-NC组(P<0.05)。结论高糖状态下RGC-5视网膜神经节细胞高表达Reg1,上调Reg1表达可以降低细胞凋亡及炎症,可能与抑制NFκB信号通路活化有关。

决明子多糖调节IL-6/JAK2/STAT3通路对高糖诱导视网膜神经节细胞损伤的影响

目的探讨决明子多糖通过调节白介素-6(IL-6)/Janus激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)通路对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的影响。方法将视网膜神经节细胞RGC-5分为:对照组(正常培养的RGC-5细胞)、高糖组(50 mmol/L葡萄糖处理细胞)、决明子多糖低剂量组(50 mmol/L葡萄糖+15 mg/L决明子多糖)、决明子多糖高剂量组(50 mmol/L葡萄糖+60 mg/L决明子多糖)、激活剂组(50 mmol/L葡萄糖+60 mg/L决明子多糖+0.5μmol/L JAK2/STAT3激活剂colivelin)、激活剂对照组(50 mmol/L葡萄糖+0.5μmol/L JAK2/STAT3的激活剂colivelin);CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELLSA法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷氨酸(Glu)含量;Western blot检测细胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表达。结果与对照组比较,高糖组RGC-5细胞的OD450值、SOD活性、PCNA表达降低,细胞凋亡率、MDA水平、Glu含量、IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达上升(P<0.05);与高糖组比较,决明子多糖低剂量组、决明子多糖高剂量组RGC-5细胞的OD450值、SOD活性、PCNA表达升高,细胞凋亡率、MDA水平、Glu含量、IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达降低(P<0.05);加入JAK2/STAT3的激活剂colivelin后,减弱了决明子多糖对RGC-5细胞增殖的促进作用,且细胞凋亡能力、氧化应激和自噬反应增强。结论决明子多糖可通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路对高糖诱导的视网膜神经节细胞起到保护作用。