CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后视网膜神经节细胞存活的影响

目的：观察大鼠视神经夹伤后玻璃体腔内注射睫状神经营养因子（CNTF）和腺病毒介导脑源性神经营养因子（Ad-BDNF）对视神经损伤后视网膜神经节细胞（RGC）存活的影响。方法：制作大鼠视神经定量夹伤模型，玻璃体腔内注射CNTF和Ad-BDNF，经上丘荧光金（FG）逆行标记RGC，计数视网膜铺片上的RGC并行统计学分析。结果：正常SD大鼠视网膜上RGC密度为2155±265个／mm。（n=12），视神经夹伤后RGC在1～2wk内下降速率最快，到3，4wk时RGC细胞数量虽仍有减少但下降速度已经明显减慢。CNTF组在视神经夹伤后1wk时视网膜RGC数显著高于对照组，但2～4wk的结果和对照组比较差异不明显。Ad—BDNF组视神经夹伤后1～4wk视网膜RGC数均显著高于对照组。结论：CNTF治疗组玻璃体腔内一次性注射CNTF可以在损伤早期2wk内为损伤的RGC提供神经营养因子，减少RGC的早期死亡。Ad．BDNF治疗组的这种保护作用可以持续到损伤后4wk，能够为RGC提供长时间地营养支持，但这种作用比较局限，可能与单一营养因子作用有关。

PTEN/SOCS3缺失对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞存活和轴突再生的影响

目的探讨磷酸酶-张力蛋白同源物(PTEN)和细胞因子信号转导抑制蛋白3(SOCS3)缺失对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)存活和轴突再生的影响。方法将Thy1-YFP/PTEN^(F/F)SOCS3^(F/F)大鼠作为对照组,玻璃体内注射腺相关病毒(AAV)介导PTEN基因缺失的Thy1-YFP/PTEN^(F/F)大鼠为PTEN^(-/-)组;玻璃体内注射AAV介导SOCS3基因缺失的Thy1-YFP/SOCS3^(F/F)大鼠为SOCS3^(-/-)组;玻璃体内注射AAV介导PTEN基因和SOCS3基因均缺失的Thy1-YFP/PTEN^(F/F) SOCS3^(F/F)大鼠为PTEN^(-/-)SOCS3^(-/-)组,每组各20只。HE染色观察各组大鼠视网膜组织病理学形态,免疫荧光染色鉴定各组大鼠RGCs存活情况,流式细胞仪检测各组大鼠RGCs凋亡情况,并对比轴突再生数量;利用Western blot检测各组大鼠RGCs中GFAP和GAP-43的蛋白相对表达水平。结果对照组大鼠视网膜细胞炎症反应明显,细胞间层次结构混乱、连接差,分散性强;PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组大鼠视网膜整体结构较规则,层次较清晰,炎症反应有所减轻;PTEN^(-/-)SOCS3^(-/-)组大鼠视网膜结构清晰,较规则,细胞之间连接紧密,炎症反应明显减轻。PTEN^(-/-)组和SOCS^(-/-)组大鼠RGCs存活率均显著高于对照组(均为P<0.001)。PTEN^(-/-)SOCS3^(-/-)组大鼠RGCs存活率均明显高于PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组(均为P<0.001)。PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组大鼠RGCs凋亡率显著低于对照组(均为P<0.001),PTEN^(-/-)SOCS3^(-/-)组大鼠RGCs凋亡率均明显低于PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组(均为P<0.001)。PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组大鼠视神经轴突数目均显著多于对照组(均为P<0.001),PTEN^(-/-)SOCS3^(-/-)组大鼠视神经轴突数目均明显多于PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组(均为P<0.001)。PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白表达均显著低于对照组(均为P<0.001),PTEN^(-/-)SOCS3^(-/-)组大鼠RGCs中GFAP和GAP-43蛋白表达均明显低于PTEN^(-/-)组和SOCS3^(-/-)组(均为P<0.001)。结论PTEN和SOCS3基因缺失与视神经损伤大鼠RGCs存活和轴突再生具有一定的关系,不仅能够促进RGCs的增殖,抑制其凋亡,还能够促进视神经轴突再生,同时敲减PTEN和SOCS3基因最为显著。

不同生长期晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞存活的促进作用

目的观察不同生长期大鼠的晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)是否具有不同的保护作用。方法分别提取出生后1 d、2周、6月、1年期的SD大鼠晶状体可溶性蛋白,加入培养的RGCs中,观察其对RGCs存活时间、突触生长状况及凋亡的影响。结果同期提取的晶状体蛋白各不同浓度作用于RGCs,促进其存活的作用有差异,最佳有效浓度为10-5g/L。不同生长期大鼠的晶状体蛋白可以延长RGCs存活时间,并随生长期增长而延长,但1 d组与2周组无显著性差异。加入晶状体蛋白后RGCs凋亡减少,随生长期增长而逐级减少。结论晶状体可溶性蛋白可显著促进离体培养的RGCs的存活和生长,晶状体蛋白的最佳有效质量浓度为10-5g/L。不同生长期晶状体蛋白的神经保护作用有所不同,随生长期延长,作用逐渐增强。

损伤晶状体对视网膜神经节细胞存活的影响

目的研究晶状体损伤对视网膜神经节细胞存活的影响。方法40只Wistar大鼠随机分为3组:正常组(8只)、单纯损伤组(16只)和晶状体损伤组(16只)。4周后处死动物,常规病理切片并计数视网膜神经节细胞的数量。结果正常组视网膜层次清楚,单纯损伤组视网膜明显变薄,晶状体损伤组视网膜虽变薄,但不如单纯损伤组明显;视网膜周边部神经节细胞数量每高倍视野下平均值正常组为53.25±1.96;单纯损伤组为4.06±1.45;晶状体损伤组为25.00±1.49。各组之间两两比较,差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。结论晶状体的损伤能够极大地提高视网膜周边部神经节细胞的存活数量,损伤后晶状体的变化在此过程中起关键性作用。

生物素化葡聚糖胺逆行标记检测嗅鞘细胞移植对视神经损伤后视网膜神经节细胞存活的影响

目的通过生物素化葡聚糖胺(biopinylated dextan amine,BDA)逆行标记的方法,检测移植嗅鞘细胞对视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)存活的影响;观察BDA逆行标记RGCs效果。方法培养纯化嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并进行活性鉴定。取纯度为95%活性最高OECs种植于10只成年SD大鼠(雌雄不限)视神经吸断处,另设10只行单纯吸断伤作为对照,两组均于术后存活4W,做视网膜铺片,记数各象限同一视野下BDA荧光标记RGCs数。结果各视野下,移植OECs组荧光标记RGCs数均显著高于对照组(P<0.01);RGCs胞体及轴突轮廓清晰。结论OECs可有效保护RGCs,减缓其凋亡速率;BDA逆行标记RGCs效果理想,可进一步推广应用。

不同穴位和频率的电针刺激对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞存活的作用

目的:研究不同穴位和频率的电针刺激对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(节细胞)存活的作用。方法:54只成年SD大鼠接受右侧视神经眶内切断术及节细胞荧光金(Fluoro Gold,FG)逆行性标记后,随机分为9组,对照组(含2、7、14 d组)及不同穴位、频率和伤后存活时间组合的电针组(含假穴4/20 Hz电针7 d组、百会穴4/20 Hz电针7 d组、睛明穴2 Hz电针7 d组、睛明穴4/20 Hz电针2、7、14 d组),每组6只动物。结果:(1)睛明穴4/20 Hz电针7 d组存活节细胞平均密度显著高于对照、假穴和百会穴组(P<0.01),而假穴和百会穴组与对照组间无显著性差异;(2)睛明穴2 Hz与睛明穴4/20 Hz电针7 d组节细胞密度虽无显著性差异,但均显著高于对照7 d组(P<0.01);(3)分别以4/20 Hz电针刺激睛明穴2、7、14 d,与对照组相同时间点相比,仅在伤后7 d出现节细胞密度的显著增高(P<0.01)。结论:以4/20 Hz与2 Hz两种不同频率的电针刺激睛明穴,均能在成年大鼠视神经切断后7 d延缓节细胞的死亡。就本研究所观察的不同穴位和频率而言,电针的神经保护作用取决于针刺穴位而非电针频率。

白细胞介素-4和白细胞介素-12对纯化培养小鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的观察白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)对于纯化培养条件下视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)生存率的影响,进一步探讨自身免疫调节紊乱与视网膜神经节细胞损害之间的关系。方法应用抗小鼠Thy1.2抗体粘附两步纯化法,得到纯化的小鼠视网膜神经节细胞。Thy1.2单克隆抗体联合神经微管蛋白-2多克隆抗体对RGCs进行免疫细胞化学双标记法鉴定RGCs纯度。TUNEL染色法检测凋亡细胞、通过细胞形态学观察计数细胞。实验分为两个阶段,首先观察IL-4和IL-12对RGCs的直接影响;然后观察在NMDA兴奋性毒性作用下IL-4和IL-12对于RGCs的影响。结果正常培养条件下,除10 U/mLIL-4外,IL-4和IL-12其余浓度组的RGC存活率均较对照组降低(P<0.0083);当有NMDA存在时,1、10、100 U/mL的IL-4和IL-12浓度组的RGCs存活率分别为79.2%、87.2%、69.5%及77.5%、76.4%和73.7%,均较单纯NMDA处理组的RGCs存活率62.25%明显提高(P<0.0083)。结论纯化的RGCs培养条件下,IL-4和IL-12不具有直接的神经保护作用,但具有增强细胞对抗NMDA兴奋性毒性损伤的作用,提示自身免疫调节紊乱可能损伤RGCs,与青光眼等发病有关。

大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长与可溶性混合晶状体蛋白的促进作用:体外培养实验

目的:观察不同培养基中血清和混合晶状体蛋白对视网膜神经节细胞的影响,探讨晶状体损伤后其促进视网膜神经节细胞存活和再生的作用。方法:实验于2004-04/07在解放军第三军医大学西南眼科医院眼科实验室完成。选择成年LongEvens大鼠8只用于可溶性混合晶状体蛋白的提取;选择新生0～2dLongEvens大鼠30只用于视网膜神经节细胞的培养。分别用下列3组培养基对离体视网膜神经节细胞进行培养:①100mL/L新生牛血清+900mL/LDMEM/F12培养基(新生牛血清+DMEM/F12组)。②100mL/L新生牛血清+100mL/L胎牛血清+800mL/LDMEM/F12培养基(新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组)。③100mL/L胎牛血清+900mL/LDMEM/F12培养基(胎牛血清+DMEM/F12组)。每组又分为6个亚组,其中5个亚组分别加入5种不同终浓度的可溶性混合晶状体蛋白(1,0.5,0.02,0.01,0.005mg/L)溶液,一个亚组不加可溶性混合晶状体蛋白液。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,记录存活细胞数和存活时间。培养2,4,6d后,计数每视野分散的、有突起生长的视网膜神经节细胞数和最长突起长度(每一视野随机取5个细胞进行测量,共30个视野,150个突起)应用LeicaQWin图像分析系统。结果:①视网膜神经节细胞存活时间:新生牛血清+DMEM/F12组培养细胞能存活六七天,新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组和胎牛血清+DMEM/F12组培养细胞能存活七八天。②有突起生长的视网膜神经节细胞数目和最长突起长度:在相同培养天数(2,4,6d)和条件下(加入同一终浓度晶状体蛋白)新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组细胞数目均多于新生牛血清+DMEM/F12组犤加入0.5mg/L晶状体蛋白,2d时(3.83±4.53比0.14±0.38)个/视野,(4d时14.7±9.62比2.5±3.89)个/视野,P<0.01;6d时(20.13±12.32比5.43±5.62)个/视野,P<0.05犦;在4d内胎牛血清+DMEM/F12组细胞突起长度明显优于新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组(P<0.01);加入混合晶状体蛋白后细胞存活时间及突起长度明显长于未加晶状体蛋白组,晶状体蛋白液含量为0.01mg/L时,作用较明显。结论:加入晶状体蛋白液和不同血清的培养基两因素间无交互作用,分别独立地发挥作用。可溶性混合晶状体蛋白可以促进体外培养的视网膜神经节细胞存活和突起生长。

压力对视网膜神经节细胞存活及突起生长影响的研究

目的 建立体外加压培养SD乳鼠视网膜神经节细胞 (RGCs)模型 ,并观察压力对RGCs存活及突起生长状况的影响。方法 取生后 0～ 3天SD乳鼠的视网膜组织 ,用酶化学方法制备成细胞悬液并接种于培养瓶中。用自行设计的体外加压模型 ,使瓶内压力分别达到 2 0mmHg、4 0mmHg、6 0mmHg和 80mmHg,同时设对照组 (压力为 0 )。分别于培养后 2 4h、4 8h和 72h在倒置显微镜下观察RGCs的存活及生长状况 ,并应用Thy 1 .1单克隆抗体对RGCs进行免疫细胞化学鉴定。结果 压力为 2 0mmHg及 4 0mmHg实验组中RGCs生长状况与对照组相似 ,RGCs存活数量及突起生长率无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;压力为 6 0mmHg及 80mmHg实验组中RGCs存活数量及突起生长率与对照组存在显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 RGCs可以在体外存活并生长 ,一定的压力 (≥ 6 0mmHg)可以影响RGCs的存活数量及突起生长率。

细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的研究细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活的影响,并探讨其潜在的分子机制。方法采用视神经横断手术构建大鼠视神经损伤模型,术后分离RGCs。实验分为视神经损伤组(optic nerve transection,ONT组)和假手术组。采用Western blot和RT-PCR检测SOCS3在两组细胞中的表达。随后将SOCS3 siRNA分别转染假手术组和ONT组RGCs,实验进一步分为空白对照组、阴性对照组和SOCS3沉默组。CCK8和MTT法检测细胞存活,Hoechst 33342荧光染色法和流式细胞技术检测细胞凋亡。进一步将mTOR siRNA和SOCS3 siRNA共转染RGCs,检测细胞存活和细胞凋亡。结果视神经损伤3d后,ONT组SOCS3表达水平显著高于假手术组(P=0.049),且随损伤时间延长而升高。与空白对照组相比,SOCS3沉默可显著提高视神经损伤后RGCs的存活率[空白对照组与SOCS3沉默组分别为(49.47±7.35)%和(73.24±8.70)%],降低细胞凋亡率[2组分别为(27.25±0.75)%和(10.96±1.07)%]和细胞生长抑制率[2组分别为(23.06±1.43)%和(10.65±1.77)%]。Hoechst染色也表明SOCS3沉默可改善视神经损伤诱导的细胞凋亡。同时,SOCS3沉默可显著提高视神经损伤后2周mTOR活性标志蛋白pS6的表达;且与单独沉默SOCS3相比,共同沉默mTOR和SOCS3可降低细胞存活率,提高细胞生长抑制率和细胞凋亡率。结论SOCS3沉默可以通过上调损伤后期mTOR的活性而促进损伤RGCs的存活并抑制其凋亡。

不同给药途径的聚乙二醇对大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞存活的影响

目的:比较不同给药途径的聚乙二醇(PEG)对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(节细胞)存活的影响。方法:72只成年SD大鼠左眼球后1.5 mm处横断视神经,眶侧断端留置浸有荧光金的明胶海绵以逆行标记存活的节细胞。术后立即尾静脉注射1 ml 30%PEG(尾静脉注射PEG组)或等体积生理盐水(尾静脉注射盐水对照组),或在视神经眶侧断端留置浸有50%PEG(局部PEG组)或生理盐水(局部盐水对照组)的明胶海绵。四组动物(n=18)分别存活2、7 d或14 d(每时间点,n=6)后处死,取术侧视网膜,平铺计数存活节细胞并计算出节细胞密度。结果:术后7 d尾静脉注射PEG组存活节细胞平均密度(1121.43 mm2±42.69/mm2)显著高于尾静脉注射盐水对照组(846.67/mm2±58.19/mm2,P<0.05),而2 d和14 d时间点两组节细胞密度间无显著性差异(P>0.05);局部PEG组节细胞密度在各时间点与局部盐水对照组相比均无显著性差异(P>0.05);在7 d点,尾静脉注射PEG组节细胞密度显著高于局部PEG组(774.43/mm2±50.49/mm2,P<0.05)。结论:PEG能在视神经切断后一定时间内延缓节细胞死亡,且这种神经保护作用有赖于PEG的给药途径。

外源性H_2O_2对大鼠纯化视网膜神经节细胞存活及轴突生长的影响

目的研究外源性H2O2对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活和轴突生长状况的影响及其与神经微丝蛋白NF-H表达变化的关系,探讨H2O2的氧化应激引起RGCs损伤的机制。方法纯化培养SD乳鼠RGCs,应用不同浓度H2O2(250、500μmol/L)分别作用4、8、24、32h后测定存活、有突起的视网膜神经节细胞数及其最长突起长度。采用免疫组织化学染色加图像分析系统检测H2O2对RGCs表达神经微丝蛋白NF-H的影响。结果纯化培养的SD大鼠RGCs纯度可达96.24%。H2O2以浓度和时间依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活数,500μmol/L的H2O2在32h可以导致RGCs存活数下降约50%。同时,500μmol/L H2O2孵育后RGCs细胞轴突长度与对照组比较明显减短,差异有统计学意义(P<0.01),且减短程度随时间延长而增大;NF-H表达差异也有统计学意义(P<0.01),且NF-H在RGCs中分布紊乱。结论 H2O2的氧化应激损伤能够以时间和浓度依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活,可影响RGCs轴突生长,这可能与其下调RGCs中神经微丝蛋白的表达有关。

阻断DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路对ITON小鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的研究阻断DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路的表达能否促进间接性创伤性视神经病变(ITON)小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的存活并比较阻断不同位点产生的阻断效果。方法使用能够产生创伤性轴突损伤(TAI)的撞击加速(IA)模型对6~8周龄的小鼠进行处理模拟间接性创伤性视神经病变,筛选出符合条件的小鼠分为4组:空白对照组,IA组,IA+sunitinib组,IA+SP600125组。在实验要求的各个时间点留取标本,进行γ-synuclein或p-c-JUN免疫荧光染色、TUNEL染色和Western blot检测,并进行统计学分析。结果免疫荧光染色结果显示,与IA组相比,IA+sunitinib组和IA+SP600125组存活的RGCs密度显著升高、p-c-JUN(+)RGCs密度显著降低(P<0.05);TUNEL检测结果显示,与IA组相比,IA+sunitinib组和IA+SP600125组凋亡的RGCs密度显著降低(P<0.05);Western blot检测结果显示,与IA组相比,IA+sunitinib组和IA+SP600125组DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路中的相应下游蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论DLK/MKK4/JNK/c-JUN通路的激活与ITON小鼠中RGCs的存活率相关,应用DLK抑制剂或JNK抑制剂可有效阻断该通路的蛋白表达,并促进RGC的存活,且后者效果更佳。

视神经损伤后JNK3、APP蛋白的表达变化对视网膜神经节细胞存活的影响

目的探讨视神经损伤后小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)中JNK3、APP蛋白的表达变化及其对RGCs存活的影响.方法取成年APP野生型小鼠,采用钳夹法建立视神经损伤模型,应用免疫组织化学、Western blot法检测造模后视网膜神经节细胞中JNK3、APP蛋白的定位和定量表达变化,比较损伤7 d后APP基因敲除组及其同窝野生型小鼠RGCs的存活数变化.结果视神经损伤后,视网膜神经节细胞中JNK3定位于细胞浆,p-JNK则从细胞浆进入到细胞核中表达,APP定位于细胞膜、p-APP在轴突及细胞浆中均表达.同时,Western结果表明上述4种蛋白表达量在损伤1 d组比假手术组均升高(P<0.01).与APP野生型小鼠视网膜神经节细胞存活数(127.7±7.0)相比,APP基因敲除组小鼠视网膜神经节细胞存活数(147±7.0)明显增多(P<0.05).结论视神经损伤后,JNK3、APP蛋白的表达增多在视网膜神经节细胞的存活中发挥了一定的作用.

MFG-E8抑制青光眼大鼠视网膜神经节细胞凋亡的机制研究

目的 探讨乳脂肪球表皮生长因子8 (MFG-E8)在青光眼大鼠视神经保护中的作用与机制。方法 构建青光眼大鼠模型,将MFG-E8或D89E注射至大鼠玻璃体腔内。检测大鼠的眼压变化。通过HE染色、TUNEL染色、免疫荧光染色分别检测大鼠视网膜组织病理损伤、节细胞凋亡和小胶质细胞激活水平;通过Western blotting检测视网膜组织中cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9和BAX蛋白表达;通过ELISA和实时定量PCR检测视网膜组织中IL-10、TGF-β和NGF的表达水平。结果 与对照组相比,青光眼大鼠的眼压显著增加,视网膜神经节细胞复合体(GCC)层变薄,凋亡节细胞增加,cleaved-caspase 3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9和BAX水平升高,IBA1阳性细胞数增加,且IL-10、TGF-β、NGF水平增高;经MFG-E8治疗后,青光眼大鼠视网膜GCC层厚度增加,cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9、BAX水平降低,IBA1阳性细胞数和IL-10、TGF-β、NGF水平均增加;而MFG-E8失活异构体D89E处理后,大鼠青光眼进展进一步加重。结论 MFG-E8能够介导小胶质细胞激活,抑制神经节细胞凋亡,减缓大鼠青光眼的进展。

藏红花素通过跨膜受体蛋白/发状分裂相关增强子1信号通路对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的探讨藏红花素对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的作用及其可能机制。方法于2021年1月至2022年1月采用不同浓度藏红花素处理视网膜神经节细胞RGC-5,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并用氯化钴(CoCl_(2))处理建立缺氧模型,分为缺氧组、藏红花素组、阳性对照(抗坏血酸)组和藏红花素+跨膜受体蛋白信号通路抑制剂(DAPT)组,另设对照组。Cell counting kit-8法检测细胞存活情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;钙荧光探针(Flou-4)实验检测各组细胞钙离子水平;实时定量PCR法检测跨膜受体蛋白(Notch1)、发状分裂相关增强子1(Hes-1)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、钙依赖性蛋白酶家族1(Cal⁃pain1)蛋白表达情况。结果藏红花素组细胞活力0.83±0.08高于缺氧组0.45±0.04,细胞凋亡率(17.92±1.21)%低于缺氧组(51.82±5.36)%,钙离子水平0.27±0.04低于缺氧组0.76±0.05,差异有统计学意义(P<0.05);藏红花素+DAPT组细胞活力0.50±0.06低于藏红花素组0.83±0.08,细胞凋亡率(36.50±3.50)%高于藏红花素组(17.92±1.21)%,钙离子水平0.65±0.05高于藏红花素组0.27±0.04,差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧组比较,藏红花素组Bcl-2蛋白表达水平升高,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与藏红花素组比较,藏红花素+DAPT组Bcl-2蛋白表达水平降低,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论藏红花素对体外培养的缺氧RGC-5细胞凋亡有一定的抑制作用,可能是通过抑制钙离子内流,阻滞Notch1/Hes-1通路,提高细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平发挥作用。

雌二醇对激素性高眼压大鼠视网膜小胶质细胞和神经节细胞的影响

目的 初步探讨雌二醇对激素性高眼压(OHT)大鼠视网膜中小胶质细胞和视网膜神经节细胞(RGCs)的影响。方法 雄性SD大鼠36只(36眼),随机分为对照组、OHT组和高眼压雌激素处理组(E2-OHT组),每组各12只。其中OHT组和E2-OHT组大鼠在结膜下给予地塞米松磷酸钠注射液,对照组注射相同体积的无菌生理盐水。造模后2周,E2-OHT组大鼠除结膜下注射地塞米松磷酸钠注射液外,同时给予雌二醇滴眼液滴眼。各组大鼠在造模后4周摘取眼球,免疫荧光染色观察大鼠RGCs数量及小胶质细胞活化情况,Western blot检测大鼠视网膜中Brn3a及离子钙结合适配器分子-1(Iba1)蛋白表达,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA的相对表达水平。结果 造模前各组大鼠眼压比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后1周、2周、3周、4周,各组大鼠眼压比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与对照组相比,造模后1周、2周、3周、4周OHT组大鼠眼压均明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与OHT组相比,E2-OHT组大鼠造模后1周、2周眼压差异均无统计学意义(均为P>0.05);造模后3周、4周眼压下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,对照组大鼠视网膜小胶质细胞主要位于内丛状层,而OHT组大鼠视网膜小胶质细胞迁移到神经节细胞层并且发生了形态学改变(阿米巴样激活状态),E2-OHT组大鼠小胶质细胞形态及分布形式与对照组大鼠视网膜染色结果基本一致。与对照组相比,OHT组大鼠视网膜中RGCs数量减少,TNF-α和IL-1β mRNA相对表达量、Iba1蛋白表达水平均升高,Brn3a蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与OHT组相比,E2-OHT组大鼠视网膜中RGCs数量增多,TNF-α和IL-1β mRNA相对表达量、Iba1蛋白表达水平均降低,Brn3a蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 雌二醇可以抑制小胶质细胞活化,降低OHT大鼠视网膜中TNF-α和IL-1β的表达,减少对RGCs的损伤。

青葙苷Ⅰ通过调节ROS介导的JNK/c-Jun信号通路增强视神经损伤模型视网膜神经节细胞的线粒体自噬

目的:探讨青葙苷Ⅰ通过调节活性氧(ROS)介导的c-Jun氨基末端激酶(JNK)/c-Jun信号通路增强视神经损伤模型视网膜神经节细胞(RGCs)线粒体自噬的作用机制。方法:选取24只SPF级新西兰大白兔,随机分为4组,每组6只,分别为假手术组、模型组、甲钴胺组、实验组。模型组、甲钴胺组、实验组复制视神经损伤模型,假手术组仅切开球结膜后缝合。模型复制成功后,甲钴胺组给与0.15 mg/kg甲钴胺水溶液灌胃,实验组30 mg/kg青葙苷Ⅰ溶液灌胃,假手术组与模型组给与等体积生理盐水灌胃,各组每日干预一次,连续干预28 d。干预结束后,采用内窥镜检测各组大白兔眼底;苏木精-伊红(HE)染色法检测各组视网膜形态学变化;TUNEL法检测各组RGCs凋亡;免疫荧光染色法检测各组视网膜ROS、parkin及P62表达,Western blot检测各组视网膜JNK、c-Jun、parkin、P62及微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达。结果:内窥镜结果显示,假手术组大白兔眼底表现正常,模型组可见眼底血供减少,视野呈现灰白色。与模型组比较,甲钴胺组与实验组可见眼底血流增加。HE结果显示,假手术组RGCs排列整齐,细胞形态规则,模型组可见RGCs数量减少、排列紊乱,与模型组相比,甲钴胺组与实验组RGCs形态改善,甲钴胺组仍存在部分RGCs形态异常,实验组RGCs总体数量较甲钴胺组多,RGCs形态异常少。与模型组相比,甲钴胺组与实验组视网膜凋亡指数较低(P<0.05),与甲钴胺组相比,实验组视网膜凋亡指数较低(P<0.05);免疫荧光法结果显示,与模型组相比,甲钴胺组与实验组视网膜组织中ROS、P62表达较低,parkin表达升高(P<0.05),与甲钴胺组比较,实验组视网膜组织中ROS、P62表达较低,parkin表达较高(P<0.05);Western blot结果显示,与模型组比较,甲钴胺组与实验组JNK、c-Jun、P62及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白表达降低,parkin蛋白表达升高(P<0.05),与甲钴胺组比较,实验组JNK、c-Jun、P62蛋白表达及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ较低,parkin表达较高(P<0.05)。结论:青葙苷Ⅰ能够减少视神经损伤模型RGCs中ROS产生,抑制JNK/c-Jun信号通路,进而增强线粒体自噬,减少细胞凋亡,对视神经损伤模型RGCs起到一定的保护作用。

蓝莓花青素调控Notch1/Hes-1通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的影响及机制研究

目的探讨蓝莓花青素(BA)对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)氧化损伤的影响及可能的作用机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组(NC组,n=10)和造模组,造模组一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg,构建糖尿病模型,造模成功后再随机分为糖尿病模型组(DM组)、蓝莓花青素组(BA组)、DAPT组(Notch1通路抑制剂)和蓝莓花青素+DAPT组(BA+DAPT组),每组10只。BA组每天给予20 mg/kg的BA灌胃,DAPT组给予10μmol/L的DAPT干预,BA+DAPT组给予20 mg/kg的BA灌胃+10μmol/L的DAPT干预,NC组和DM组用等量0.9%氯化钠溶液(生理盐水)灌胃,连续8周。于末次给药24 h后,摘取大鼠眼球,用酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒检测各组大鼠视网膜组织中活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠视网膜组织病理变化,并进行RGC计数;用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量HO-1和iNOS mRNA表达;Western blot法检测Notch1和Hes-1蛋白的表达。结果建模后,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组空腹血糖(FBG)值均大于16.7 mmol/L;经BA干预治疗后,BA组和BA+DAPT组FBG含量明显降低,BA组低于BA+DAPT组(P<0.05)。ELISA结果表明,与NC组比较,DM组视网膜组织中ROS和MDA含量升高,CAT和SOD含量降低(P<0.05);与DM组比较,BA组和BA+DAPT组视网膜组织中ROS和MDA水平下降,CAT和SOD水平显著上升(P<0.05)。光学显微镜观察显示,NC组视网膜结构清晰,细胞形态正常,排列整齐;DM组大鼠RGC层排列紊乱,内、外核层伴随有水肿,出现了空泡现象,视网膜厚度变薄;BA组大鼠视网膜层结构排列较整齐,水肿程度和视网膜厚度较DM组有一定的改善;BA+DAPT组大鼠视网膜组织较DM组有所改善,但视网膜厚度相比BA组还是较薄。RGC计数结果显示,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组RGC数量分别为7.35±1.28、12.05±1.52、5.61±1.72、8.72±1.19,明显低于NC组的16.63±1.54,组间差异有统计学意义(F=88.905,P<0.05)。qRT-PCR结果表明,NC组、DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组大鼠视网膜组织中HO-1水平分别为1.28±0.32、0.68±0.15、1.03±0.19、0.50±0.13和0.73±0.11,iNOS水平分别为0.48±0.08、1.17±0.21、0.89±0.17、1.35±0.15和1.10±0.23,差异均有统计学意义(F=25.192、35.843,P<0.05)。Western blot结果显示,与NC组相比,DM组视网膜组织中Notch1和Hes-1蛋白表达均下调;与DM组比较,BA组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均上调,DAPT组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均下调,BA+DAPT组两蛋白表达低于BA组,组间差异有统计学意义(F=47.626、54.709,P<0.05)。结论BA可以降低糖尿病大鼠FBG,增强其抗氧化应激能力,改善视网膜组织病理学损伤,从而对神经节细胞起到保护作用,其作用机制可能与激活Notch1/Hes-1信号通路有关。

中医药调控缺血缺氧微环境对青光眼治疗及视网膜神经节细胞凋亡的研究进展

青光眼是首位不可逆性致盲眼病,严重威胁人类视觉健康。当前常规治疗方法是使用眼药水、手术等方式以降低眼内压,但是临床长期疗效差强人意。青光眼最主要的病理基础为神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)退行性改变及凋亡,临床及实验研究发现缺血缺氧微环境的改变常常会加重RGCs的凋亡,而如何延缓甚至抑制其凋亡是当前研究的热点。气血理论是中医核心概念之一,中医药具有多组分、多途径、多靶标的作用特点,对于复杂病理机制所导致的视网膜缺血缺氧微环境改变具有独特的治疗优势和潜力。随着近年来中医药研究的不断发展,中药在保护RGCs方面取得了不少新的研究。该文就中药有效活性成分和复方制剂在保护RGCs的有效性及潜在机制方面进行了总结,以期为临床工作中更有效地抑制RGCs凋亡、改善视功能提供一定的借鉴意义。