视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用q PCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.000 1);Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。

青光安颗粒剂含药血清对体外培养大鼠视网膜神经节细胞调亡的实验研究

目的为初步探讨中药青光安含药血清对体外培养视网膜神经节细胞(RGCs)的作用机制和为中药对青光眼的体外疗效研究提供一种新的研究方法。方法:不同浓度青光安颗粒剂和益脉康片剂给3月龄SD大鼠灌胃,获取不同含药浓度的大鼠血清;建立视网膜神经节细胞纯化培养的常压和高压模型,并用流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率;利用流式细胞仪进行细胞凋亡中Bcl-2、Bax等凋亡蛋白的检查。结果:成功获取中药的含药血清,并将其用于视网膜神经节细胞的体外培养;成功分离并培养了视网膜神经节细胞纯化培养模型,RGCs的混合培养最长可存活3-6周,RGCs的纯化培养可存活时间4-7天;成功对纯化培养的细胞进行压力造模。压力20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg,加压时间1-4小时均能促进RGCs的凋亡,其凋亡细胞的数目以80mmHg、4小时为最多(P<0．01)。含药血清作用于纯化培养的视网膜神经节细胞后,Bcl-2的表达随青光安含药浓度的增高而增高,Bax的表达随青光安含药浓度的增高而降低。结论:压力能促进RGCs的凋亡,其凋亡细胞的数目随压力的增大、加压时间的延长而增加;青光安含药血清能延缓RGCs的凋亡,对其有保护作用;利用含药血清对体外培养的细胞进行试验,是中药药效试验的重要方法之一。

巨噬细胞培养液对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞的作用研究

目的研究巨噬细胞培养液对离体培养的视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)存活和生长的作用,探讨损伤晶状体促进RGCs存活和轴突再生的作用物质,为视神经损伤和再生的基础研究提供理论依据。方法制备大鼠巨噬细胞培养液,分别用巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行离体培养,观察RGCs在体外存活的时间,测量培养1d、3d和5d有突起的RGCs数目及最长突起长度,进行组间比较。结果(1)对照组离体培养的细胞于培养5～6d崩解死亡,而巨噬细胞培养液组细胞能存活6～8d;(2)培养1d、3d和5d,巨噬细胞培养液组有突起的RGCs数目分别为(59.74±2.04)个.mm-2、(96.78±4.11)个.mm-2和(99.26±3.04)个.mm-2,均明显多于同期对照组,差异非常显著(P<0.01);(3)培养1d和3d,巨噬细胞培养液组RGCs最长突起长度分别为(39.70±0.71)μm和(76.19±1.56)μm,较对照组延长,差异非常显著(P<0.01)。培养5d,RGCs最长突起长度与对照组比较差异显著(P<0.05)。结论巨噬细胞培养液可促进离体培养的RGCs存活和生长。

无血清神经基质培养基培养纯化的视网膜神经节细胞

目的建立无血清培养基培养纯化原代视网膜神经节细胞（RGCs）的方法，为研究青光眼等引起的RGCs损伤及防护提供理想的细胞模型。方法出生后1～3d的SD大鼠视网膜细胞悬液，分别经抗大鼠信号调节蛋白（CD172G）单克隆抗体筛除巨噬细胞、抗大鼠Thy-1单克隆抗体筛选RGCs的两步筛选法，得到纯化的RGCs。用加入B27、睫状神经营养因子等的无血清神经元专用神经基质（neurobasal）培养基进行培养，通过细胞形态学观察、Thy-1免疫荧光细胞化学染色、钙黄绿素-乙酰乙酸酯（AM）染色等方法观察原代培养的视网膜神经细胞及纯化培养的RGCs生长并进行鉴定。结果原代培养的视网膜细胞中约91％为神经细胞。纯化培养的RGCs接种后24h有突起长出；第4～8天可见细胞形态均一，细胞体较大，细胞突起较长；至第14天，仍有超过60％的细胞有活性。Thy-1的免疫荧光细胞染色结果显示RGCs纯度约为90％。钙黄绿素-AM染色存活的RGCs，结果显示RGCs细胞体较大，多数细胞有长度大于细胞体直径2倍的突起。结论该方法培养的RGCs大小均一、形态理想、纯度高，适宜研究各种因素引起的RGCs损伤及保护剂效果评价。

胎牛血清传代培养诱导新生大鼠视网膜干细胞向视网膜神经节样细胞分化的研究

目的：探讨胎牛血清（ FBS）传代培养诱导新生大鼠视网膜干细胞向视网膜神经节细胞（ RGCs）分化的可能性，为视网膜细胞体外诱导研究提供新思路和新方法。方法本研究采用新生5d的大鼠作为实验动物，来源于北京维通利华实验动物技术公司。采用贴壁培养法分离小鼠视网膜细胞的胰蛋白酶，在10％FBS的DMEM／F12培养基中传代培养，经过连续传代纯化细胞。通过免疫荧光法和逆转录-聚合酶链式反应（ RT-PCR）鉴定诱导细胞的分化情况。结果大鼠视网膜混合细胞原代培养24 h后，可见部分细胞开始贴壁、伸展，但仍有大量细胞悬浮。48 h换液时，可见大量细胞呈短梭形，分散贴壁生长。4 d后可见细胞呈集落样生长，具有典型的RSCs形态；7～10 d后细胞融合成片，可传代。传代后12 h内细胞贴壁，多呈长扁形，双极性，末端呈分枝状。传至第3代时，细胞生长最旺盛；传至第5代时，细胞生长减缓，形态趋于一致。免疫荧光鉴定表达蛋白的结果：（1）原代混合细胞：表达光感受器标志物及干细胞标志物Nestin，节细胞标志物Thy-1，视紫红质及Muller胶质细胞标志物谷氨酰氨合成酶。从荧光强度和数量可以看出，与本身细胞核染色密度相比，光感受细胞、节细胞和Muller胶质细胞的数量并不多，且存在大量表达阳性Nestin的RSCs；（2）高血清培养体系纯化的第5代细胞：细胞形态未发生改变，表达视网膜神经节细胞的标志物Thy-1、Nogo-R及Tuj1，均呈强阳性。 RNA的含量为0．287μg／ml，RNA纯度为1．66。电泳结果：（1）第1代F1细胞PCR的结果：RPCs的标志物Nestin及Masushi为阳性，证明存在一定数量的RSCs。而成熟节细胞的标志物Thy-1为弱阳性，证明成熟RGCs细胞的含量不高。阳性对照的Actin为强阳性。（2）第5代F5细胞PCR的结果：RPCs的标志物Nestin及Masushi为弱阳性，证明残留的RSCs数量较低。而成熟节细胞的标志物Thy-1为强阳性，证明产生了大量的类节细胞。阳性对照的Actin为强阳性。大鼠视网膜混合细胞存在发育成熟的光感受器细胞、神经节细胞及胶质细胞，但细胞数量并不多，且存在一定数量的RSCs。经高血清贴壁诱导后，RSCs可分化为大量具有RGCs标志物的细胞。结论在体外分离的SD大鼠视网膜混合细胞中存在RSCs。通过FBS体系的传代诱导，可得到具有RGCs表型的细胞。

清肝利水方调控TRPC6/Ca^(2+)通路抑制慢性青光眼RGC凋亡的研究

目的观察清肝利水方(QGLS)在慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGC)凋亡中的抑制效果,并探讨其作用机制与瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)/Ca^(2+)信号通路的关系。方法制备大鼠QGLS含药血清,进行细胞毒性试验,确定合适的干预浓度。用CoCl_(2)和无糖DMEM建立RGC-5细胞缺氧缺糖-复氧复糖损伤模型,CCK-8检测正常对照组(CG)、模型组(MG)和低、中、高浓度清肝利水方含药血清组(LQGLS、MQGLS、HQGLS)的细胞增殖力,细胞凋亡试验检测细胞凋亡水平,Western Blot检测各组TRPC6、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达,Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度。结果(1)实验条件筛选:筛选出QGLS含药血清干预浓度为5%,CoCl_(2)造模浓度与时间为600μM处理24 h。(2)细胞存活率:LQGLS、MQGLS可显著提高缺氧缺糖-复氧复糖损伤的细胞存活率,与MG比较有统计学意义(t_(LQGLS)=25.401,t_(MQGLS)=11.805,均P=0.000)。(3)TRPC6表达:MQGLS、HQGLS较MG显著降低,差异均有统计学意义(t_(MQGLS)=7.365,t_(HQGLS)=9.075,均P=0.000)。(4)凋亡因子:①Caspase-3表达,3个QGLS剂量组较MG均显著下降,差异均有统计学意义(t_(LQGLS)=4.816,P=0.001;t_(MQGLS)=35.131,P=0.000;t_(HQGLS)=28.227,P=0.000);②Bax表达,3个QGLS剂量组较MG均显著下降,差异均有统计学意义(t_(LQGLS)=14.912,t_(MQGLS)=10.194,t_(HQGLS)=12.838,均P=0.000);③Bcl-2表达,3个QGLS剂量组较MG均显著升高,差异均有统计学意义(t_(LQGLS)=8.871,t_(MQGLS)=12.729,t_(HQGLS)=9.298,均P=0.000)。(5)细胞内Ca^(2+)荧光强度:MG及3个QGLS剂量组较CG均显著升高,差异具有统计学意义(t_(MG)=13.960,P=0.000;t_(LQGLS)=5.889,P=0.001;t_(MQGLS)=7.877,P=0.000;t_(HQGLS)=17.815,P=0.000)。LQGLS、MQGLS较MG细胞内Ca^(2+)浓度显著下降,差异具有统计学意义(t_(LQGLS)=7.881,t_(MQGLS)=6.204,均P=0.000),HQGLS较MG差异无统计学意义(P>0.05)。结论QGLS可降低RGC-5中Caspase-3、Bax表达,提高Bcl-2表达,抑制RGC凋亡,保护视神经,其作用机制可能与降低TRPC6表达以减少Ca^(2+)内流相关。