缺氧对培养人视网膜色素上皮细胞线粒体酶活性的影响

目的 研究缺氧对培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞线粒体琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase,SDH)和细胞色素氧化酶(cytochromeoxi dase,COX)活性的影响,以及缺氧对RPE细胞增生的作用。方法 氯化钴(CoCl2 )法建立培养人RPE细胞缺氧模型。于缺氧后0 .5h、1h、2h、4h、6h、8h、16h和2 4h ,用组织化学法测定SDH和COX活性。于缺氧后第1天、2天、3天、4天和5天,用四甲基偶氮唑蓝[3(4,5dimethylthiazole 2 yl) 2 ,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT]比色法检测RPE细胞增生。结果 RPE细胞SDH和COX活性随缺氧时间延长而逐渐降低,与对照组有显著性差异(P <0 .0 5 )。缺氧组RPE细胞增生能力增强(P <0 .0 5 )。结论 缺氧可使RPE细胞线粒体酶活性降低,并刺激RPE细胞增生。

两步酶分层消化法用于大鼠视网膜色素上皮细胞的培养

目的探索体外分离、培养大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法,建立其体外培养模式。方法采用两步酶分层消化法分离获取大鼠RPE细胞,F12培养液培养;生长曲线、细胞分裂时间等指标观察细胞生存活力及增生状态;光镜、免疫组织化学法形态学鉴别及细胞鉴定,电镜观察超微结构。结果收获的大鼠RPE细胞纯度高,量多,体外生长旺盛,达到融合的时间较短。原代细胞呈多角形,含大量色素;传代细胞呈梭形。电镜显示胞浆内含黑色素颗粒及各种细胞器。结论两步酶分层消化法是分离培养大鼠RPE细胞的理想方法,培养的细胞可用于RPE的体外实验研究。

培养人视网膜色素上皮细胞中β-半乳糖苷酶活性研究

目的 观察培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞中复制衰老相关的 β 半乳糖苷酶活性。 方法 在培养的RPE细胞中 ,以传代次数 ( 5、10、2 0 )和取材供体的年龄 ( 2 6、44、5 7岁 )分组 ,进行标准化的 β 半乳糖苷酶活性和细胞增殖能力检测。结果 培养RPE细胞中 β 半乳糖苷酶活性阳性细胞数量随传代次数的增加而增加 ,在 2 0代的细胞中 ,阳性细胞的数量为 87%± 1 2 % ,明显高于第 5代和第 10代细胞 (P <0 0 5 )。而细胞的增殖能力明显下降 (P <0 0 5 )。结论 培养RPE细胞复制衰老的发生与细胞传代次数和取材年龄相关 。

褪黑素对高糖刺激人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的研究褪黑素对高糖刺激体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。方法培养人RPE细胞,分为对照组、甘露醇组、高糖组和高糖+褪黑素组,作用48h后,光镜观察细胞形态;MTT法检测细胞活性;免疫荧光染色法和Western blot检测RPE细胞中iNOS的蛋白表达。结果MTT检测结果表明高糖可以抑制RPE细胞增生,加入褪黑素后,抑制作用减弱;免疫荧光染色法和Western blot检测结果表明,与对照组相比,高糖组iNOS蛋白表达明显增高,加入褪黑素后,iNOS表达被显著抑制。结论高糖可以抑制RPE细胞增生,诱导RPE细胞iNOS的表达上调,而褪黑素可减轻细胞损伤。

高糖对人视网膜色素上皮细胞Na-K-ATP酶表达的影响

目的观察高糖对人视网膜色素上皮(RPE)细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达的影响。方法采用ARPE-19细胞,培养4周后分为高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L)与对照组(葡萄糖浓度7mmol/L),继续培养2周、4周,RT-PCR法检测Na-K-ATP酶α1、Na-K-ATP酶β1的mRNA表达水平的变化,Western blot法检测Na-K-ATP酶β的蛋白表达情况。结果高糖抑制Na-K-ATP酶α1与β1的mRNA表达,2周、4周时α1与β-actin光密度比值分别为0.17、0.23,对照组分别为0.37、0.36;β1与β-actin光密度比值分别为0.69、0.41,对照组分别为0.98、0.83;Na-K-ATP酶β蛋白表达水平较对照组降低,2周、4周时与β-actin的比值分别为0.51、0.25,对照组分别为0.65、0.68。结论高糖环境下人RPE细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达水平降低,可能参与了黄斑水肿的发生。

乙酰肝素酶抑制剂对体外培养视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase-1,HPA-1)抑制剂应用对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖的影响。方法:采用DMEM培养基(Dulbecco's modified eagles medium,DMEM)体外培养人RPE细胞,选择第5代细胞用于实验。倒置显微镜下直接观察不同质量浓度硫代磷酸甘露醇戊糖(phosphomannopentaose sulfate,PI-88)对人RPE细胞体外生长的干预效果,应用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny1 tetrazolium bromide,MTT]比色法检测RPE细胞A570值;免疫组织化学方法检测人RPE细胞角蛋白和HPA-1表达。结果:体外增生的RPE细胞胞浆和细胞核HPA-1呈强阳性表达,以细胞浆内表达为主,PI-88干预后细胞浆表达减弱。PI-88对体外RPE细胞的增生有明显的时效和量效抑制关系,药物干预72h细胞A570值随质量浓度不同表现明显下降趋势(P<0.05);而同一质量浓度,药物质量浓度达到100mg/L及以上时,48～72h才表现A570值减小的趋势。结论:HPA-1抑制剂可抑制体外培养RPE细胞的增生,并呈现剂量和时间依赖关系。

过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的上调作用

目的:探讨过氧化氢诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的影响。方法:分别选择0,100,300μmol/L过氧化氢作用ARPE-19细胞4h后收集样本,Western blot方法检测细胞中20S蛋白酶体表达水平,细胞免疫荧光方法检测20S蛋白酶体在细胞中的分布。结果:100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞中20S蛋白酶体的表达和对照组相比明显增加(100μmol/L过氧化氢处理组vs0和300μmol/L过氧化氢处理组,P<0.05),并呈现剂量依赖性。正常培养情况下,细胞内20S蛋白酶体在核周微量表达,100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞内20S蛋白酶体和对照组相比明显增加,其分布集中在核内及核膜周围。结论:过氧化氢对ARPE-19的20S蛋白酶体表达有上调作用。

巴曲酶对视网膜色素上皮细胞增生活性的影响

目的探讨巴曲酶对视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增生活性的影响。方法利用体外培养的RPE细胞系,应用噻唑兰比色法观察不同浓度的巴曲酶对RPE增生活性的影响。结果当巴曲酶浓度不大于1/10KU.mL-1时各浓度巴曲酶组(1/100KU.mL-1、1/32KU.mL-1、1/16KU.mL-1、1/10KU.mL-1)与对照组吸光度(optical density,OD)值差异无统计学意义(P=0.068、0.455、0.675、0.159);巴曲酶浓度为1/8KU.mL-1时OD值明显降低(P=0.000)。OD值与培养液渗透压呈明确的负相关(r=-0.951,P=0.000);巴曲酶组和等渗对照组OD值的差异没有统计学意义(P=0.749)。结论渗透压符合RPE生长要求的前提下,巴曲酶对体外培养的RPE增生无明显影响,其应用于玻璃体手术中控制眼内出血的可行性值得进一步研究。

过度光照后诱导型一氧化氮合酶在大鼠视网膜色素上皮的表达

目的探讨过度光照诱导大鼠视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞表达诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的作用及其病理学意义。方法应用免疫组织化学的方法分别检测处于自然光照环境中的正常大鼠及接受强光过度照射后大鼠的视网膜RPE细胞中iNOS的表达情况。结果正常大鼠RPE细胞中未见iNOS的表达,而过度光照后大鼠RPE细胞的胞浆中表达高水平的iNOS,同时视网膜外核层感光细胞发生结构损伤。结论过度光照可诱导RPE细胞表达iNOS,这一异常改变可能是视网膜感光细胞结构损伤的重要原因。

人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶和活性氧在高糖状态下的表达

背景:高血糖导致的自由基损伤是糖尿病视网膜病变发病机制的中心环节。目的:观察高糖对体外培养的人视网膜色素上皮细胞的氧化损伤作用以及高糖对人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶和活性氧表达的影响。方法:将培养人视网膜色素上皮细胞,分为对照组、高糖组和甘露醇组,分别用含5.5mmol/L葡萄糖,33mmol/L葡萄糖及5.5mmol/L葡萄糖和27.5mmol/L甘露醇的DMEM培养液培养。采用相差倒置显微镜观察细胞生长形态,采用免疫荧光染色研究诱导型一氧化氮合酶和3-硝基酪氨酸蛋白表达的变化,用氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯荧光染色检测视网膜色素上皮细胞中活性氧的产生量。结果与结论:与对照组相比,应用含33mmol/L葡萄糖的DMEM培养基处理视网膜色素上皮细胞48h可见细胞胞体变薄,形态表现多样,不规则细胞增多;高糖培养的视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶和3-硝基酪氨酸蛋白表达增加,活性氧产生明显增多。说明高浓度葡萄糖培养可造成人视网膜色素上皮细胞氧化损伤,使细胞形态发生变化,并导致细胞中3-硝基酪氨酸产生增多。

二十二碳六烯酸抑制氧化应激状态下人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的：观察二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）对外源性H2O2诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响及分子机制。方法：体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,加入终浓度为12.5 mol/L的H2O2诱导氧化应激,随后用30-100μmol/L DHA作用细胞4-24 h;real-time PCR和Western blot分别检测血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）mRNA和蛋白的表达;比色法分析HO-1酶活性;荧光探针检测活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的产生;免疫荧光检测转录因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2）的核转位。最后通过HO-1 siRNA干扰后,流式细胞术观察其对ARPE-19细胞凋亡的影响。结果：DHA能以浓度依赖性方式诱导ARPE-19细胞表达HO-1 mRNA和蛋白,同时,HO-1的酶活性也随着DHA浓度的递增而增强;DHA处理也能诱导Nrf2核转位。此外,H2O2处理可促进ARPE-19细胞凋亡,并诱导其产生ROS。同时给予100μmol/L DHA处理后,细胞凋亡率和ROS生成显著降低。转染HO-1 siRNA或用HO-1抑制剂Zn PP处理后,可明显降低DHA对细胞凋亡率和ROS的抑制作用。结论：DHA可能通过Nrf2途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用。

菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子表达的影响

目的探讨菩人丹超微粉(PRD)对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法 48只Wistar大鼠随机分为4组:正常对照组、糖尿病模型组、PRD组和导升明组,每组12只。糖尿病模型组、PRD组和导升明组大鼠均采用链脲佐菌素连续腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立后,PRD组和导升明组大鼠分别给予PRD或导升明灌胃,时间均为3个月。采用免疫组织化学染色、Western blotting检测视网膜VEGF、PEDF蛋白的表达;RT-PCR检测视网膜VEGF、PEDF mRNA的表达。结果正常组大鼠视网膜VEGF蛋白及mRNA表达水平分别为0.4705±0.0668、0.4377±0.0372,糖尿病模型组为1.5874±0.1467、0.9332±0.0463,模型组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01);PRD组大鼠视网膜VEGF蛋白及mRNA表达水平分别为0.9050±0.0983、0.5251±0.0114,导升明组为0.9123±0.0548、0.5499±0.0320,与糖尿病模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01);PRD组与导升明组比较差异无统计学意义(P>0.05)。正常组大鼠视网膜PEDF蛋白及mRNA表达水平分别为1.3349±0.1201、1.0258±0.0385,糖尿病模型组为0.5406±0.0601、0.2671±0.0199,模型组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01);PRD组大鼠视网膜PEDF蛋白及mRNA表达水平分别为0.9625±0.0186、0.6573±0.0595,导升明组为0.9334±0.0094、0.6379±0.0677,与糖尿病模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01);PRD组与导升明组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PRD可上调糖尿病大鼠视网膜PEDF表达,下调VEGF表达。

兔视网膜色素上皮细胞培养方法的改进

目的:寻求一种更好的培养兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法。方法:在无菌滤纸上剪开眼球,固定眼杯,用胰酶直接消化视网膜色素上皮面,收取RPE细胞。将初次换液时间由取材后48 h延长至72 h,记录改变换液时间对细胞数量及细胞形态等的影响。用多巴(DOPA)染色和免疫组织化学对细胞鉴定。结果:采用改进后方法收取的细胞呈分散均匀生长。延长初次换液时间为72 h后获得的细胞增多,原代细胞长至融合状态需要的时间缩短,色素颗粒脱失现象减轻。结论:采用该方法更适于RPE细胞的收获和培养。

TGF-β_1诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡过程中Survivin基因的表达及意义

目的探讨转化生长因子β1(TGFβ1)诱导人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡过程中Survivin基因的表达及意义。方法用免疫组织化学染色法检测人RPE细胞Survivin蛋白的表达;用AnnexinVFITC标记法测定TGFβ1作用下的人RPE细胞凋亡发生率;用RTPCR方法检测不同质量浓度TGFβ1作用下人RPE细胞Survivin基因的表达。结果免疫化学染色法显示:人RPE细胞表达Survivin基因;AnnexinVFITC标记法检测结果显示:人RPE细胞的凋亡率随着TGFβ1质量浓度的升高而增高;RTPCR结果显示:随着TGFβ1质量浓度的升高,Survivin基因的表达逐渐降低。结论Survivin基因在人RPE细胞的凋亡过程中起着非常重要的作用。

有色光对视网膜色素上皮细胞分泌TGF-β的影响

目的研究不同色光对RPE细胞分泌生长因子的影响,从细胞生物学和分子生物学水平探讨RPE细胞在有色光信号传导中的作用.方法将第二代RPE细胞以每孔5×104的密度接种于4个6孔板,培养3 d后,将培养液换为含1%胎牛血清的F12培养液,置于各种色光下培养,分别于4、8、12、24、48h后收集培养液,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA),测定TCF-β的量;将置于红色、黄色和蓝色光下照射24h后的细胞取出,采用Trizol一步法提取RPE细胞总RNA,通过RT-PCR检测不同色光照射后RPE细胞TGF-β的mRNA表达水平.结果 ELISA结果显示人胚RPE细胞可分泌TGF-β,在受到不同波长的光照射后,不同时段TGF-β的分泌量也不一样,数据采用两因素方差分析,差异有统计学意义;RT-PCR结果显示不同色光照射24h后RPE细胞TGF-β的mRNA表达水平不同.结论有色光线可能引起RPE细胞蛋白质合成功能受阻,进而对眼球的生长发育产生作用.

蓝光诱导猪视网膜色素上皮细胞复制衰老的实验研究

目的观察蓝光对猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞复制衰老过程中衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence associated-beta-galactosidae,SA-β-Gal)的影响。方法将第3～6代猪 RPE 细胞置于自制蓝光发光二极管(light emitting diode,LED)光源下,波长450～500 nm,1h/d;细胞表面水平光照强度分别为(500±100)lux、(1000±200)lux、(2000±500)lux,光照时细胞水平面的温度变化为36.5～37.5℃;对照组用黑纸完全包裹培养瓶。将各组细胞消化后接种于24孔板和96孔板培养24 h,进行 SA-β-Gal 活性的检测和 MTT 法检测细胞增殖情况。结果随光照强度和传代次数增加,细胞内出现蓝色颗粒的阳性细胞数目逐渐增多,SA-β-Gal活性增高,除高强度与中强度光照组、第4代和第5代之间相比差别没有统计学意义(P>0.05)外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义(P<0.05);通过 MTT 法检测,细胞的增殖能力随光照强度和传代次数增加而降低,除中强度与低强度光照组相比差别没有统计学意义(P>0.05)外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论蓝光可以诱导体外培养猪 RPE 细胞复制衰老,并且光照强度增加可以促进细胞复制衰老。

全反视黄酸对培养的人视网膜色素上皮细胞的影响

目的观察全反视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对培养的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epitheli-um,RPE)的形态、增殖以及对RPE细胞中转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)表达的影响,并探讨ATRA与近视的关系。方法RPE传代至第3代后以1×105/孔的密度接种于96孔板或以1×106的浓度接种于250ml培养瓶,以10%FBS的F12培养液培养48h后转为0.5%FBS的F12培养液,12h后培养液转换为F12和1nM/ml、5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml、30nM/ml的ATRA。以未加ATRA组作对照。48h后观察RPE细胞形态,并以MTT法测定其增殖情况,以流式细胞技术检测其细胞凋亡情况,以免疫组化方法检测RPE细胞TGF-β2表达,并以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)方法测定其上清液的TGF-β2浓度。结果不同浓度的ATRA对RPE细胞的形态、增殖有不同的影响。<10nM/ml的ATRA对RPE细胞的增殖无影响,细胞形态正常,MTT法显示在这些浓度下ATRA对RPE的增殖影响差异无显著性(P>0.05);10nM/ml、20nM/ml、30nM/ml的ATRA抑制RPE的增殖,MTT法显示ATRA对RPE有明显的抑制作用(P值分别为P<0.05,P<0.01,P<0.001),该效应呈剂量依赖性反应。RPE细胞增大变平,突起减少,部分裂解,活力减弱。流式细胞技术检测提示,10nM/ml、20nM/ml、30nM/ml浓度下细胞凋亡率分别为14.58%、19.95%和21.69%。免疫组化方法检测提示,当RPE的ATRA浓度大于10nM/ml时,TGF-β2的表达随浓度增高而增加。ELISA结果显示,ATRA浓度>10nM/ml时,RPE分泌TGF-β2的浓度增加。结论1nM/ml、5nM/ml的ATRA可维持培养的人RPE的生长,≥10nM/ml引起RPE的增殖抑制,并可诱导RPE的凋亡。10nM/ml及以上的ATRA引起的RPE病理性改变为理解近视眼的RPE改变提供了一条思路,≥10nM/ml的ATRA诱导RPE的TGF-β2表达增加可能导致TGF-β2拮抗碱性成纤维细胞生长因子的作用增强,使后者抑制近视发生的作用减弱而促进近视的发展。

YVAD-cmK及DEVD-CHO对培养的人视网膜色素上皮细胞光损伤的影响

目的 观察半胱天冬酶(caspase-3)选择性抑制剂天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酰胺醛(Asp-Glu-Val-Asp-CHO,DEVD-CHO),及caspase-1选择性抑制剂酪氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酰胺(Tyr-Val-Ala-Asp-cmK,YVAD-cmK)对可见光诱导的培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡的影响。方法 用(2000±500)lx的白色荧光灯光源,照射培养的人RPE细胞。在培养液中加入YVAD-cmK和DEVD-CHO,利用荧光素标记的连接素V/碘化丙锭双染色流式细胞测定观察RPE细胞的凋亡情况。结果 本研究模型下,DEVD-CHO预处理组的细胞凋亡及坏死与无光照组相比,差异无显著性(P>0.05),与光照组及YVAD-cmK预处理组相比,细胞存活数增高,差异有显著性(P<0.05)。而YVAD-cmK组与无光照组比较,其结果与单纯光照组一样,表现出细胞的明显损伤(P<0.05)。结论 可见光诱导培养的人RPE细胞凋亡的发生机制中,可能不涉及casrpase-1的作用。外源性的caspase-3抑制剂(DEVD-CHO)对RPE细胞光性损伤有一定的保护作用。

基因转染的虹膜色素上皮细胞移植后RCS鼠视网膜BDNF表达观察

目的探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因转染的虹膜色素上皮细胞(AAV-BDNF-IPE)移植入皇家外科学院(royal college of surgeons,RCS)大鼠视网膜下腔后,不同时期视网膜组织BDNF表达变化。方法通过外路途径将BDNF基因转染的虹膜色素上皮细胞移植到RCS大鼠视网膜下腔,术后3、5、7、9、11周分别取RCS大鼠手术眼及对照组动物眼视网膜组织,用酶联免疫吸附法(Elisa)检测视网膜组织中BDNF的表达水平,比较分析这些数据。结果对照组RCS大鼠出生后3周龄时视网膜组织中BDNF仍保持较高水平,其后迅速降低,其中3周龄组与其它周龄组比较,P<0.01;手术组RCS大鼠术时、术后3、5、7、9、11周各组间两两比较,BDNF表达无显著差异(P>0.05);出生后6周龄直到14周龄的不同时期,AAV-BDNF-IPE移植手术组RCS大鼠视网膜BDNF表达水平均明显高于对照组(其中6周龄组P<0.05,其它各周龄组P<0.01)。结论 BDNF基因转染的虹膜色素上皮细胞在RCS大鼠视网膜下腔移植后,视网膜组织中BDNF可以持续稳定高水平表达,这为临床开发新的神经营养因子给药方式提供了实验依据。