Leber先天性黑曚患者临床特征与基因筛查

目的:对Leber先天性黑矇的临床表现以及遗传学特点予以分析,并对已知的和可能存在的致病基因突变位点进行筛查研究.方法:以56例Leber先天性黑矇患者为研究对象,收集其临床资料.使用多聚酶链式反应技术(PCR)将Lerber先天性黑矇致病相关致病基因视网膜色素上皮基因(RPE65)和卵磷脂视黄醇酰基转移酶基因(LRAT)中的全部外显子与外显子-内含子接会处进行扩增,测序分析致病的突变基因.结果:对56例患者行RPE65基因十四个外显子和LRAT基因三个外显子的检测,发现了7处单核苷酸多态性改变.结论:由于Leber先天性黑曚的临床表现具有多样性,其诊断有赖于症状和眼底表现以及各项辅助检查.本组56例患者可能与RPE65外显子和LRAT外显子突变无关.不同患者均发现同一位点的同样单核苷酸多态性的改变,具有一定的临床价值和基础研究意义,应增加样本量对蛋白功能进一步分析.

大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体的构建及其对大鼠RPE细胞中Slit2基因的下调作用

背景年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人致盲的首要原因。目前，AMD的治疗方式在取得显著疗效的同时亦有一定的不足，寻找新的有效治疗靶点是当前的研究热点。目的构建大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体，筛选有效干扰序列以用于大鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞中Slit2基因沉默，为大鼠相关体内实验奠定基础。方法设计2条大鼠Slit2基因siRNA序列，退火形成DNA，连接形成慢病毒干扰载体并进行测序鉴定。采用三质粒共转染293T细胞法收获慢病毒（Lv-rSlit2-siRNA），用药物筛选法测定病毒悬液滴度。将大鼠RPE细胞分为空白对照组、空病毒组、Lv—rSlit2-siRNAl组和Lv—rSlit2-siRNA2组，根据分组分别用仅有病毒的载体和不同序列的Lv—rSlit2-siRNA载体转染细胞，分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定各组细胞中Slit2mRNA及蛋白的表达以确定Slit2基因的敲减率，筛选有效干扰序列。采用0、100、200和400μmol／LCoCl，孵育大鼠RPE细胞以制备缺氧细胞模型并转染筛选Lv—rSlit2-siRNA2干扰序列，采用实时荧光定量PCR法和ELISA法测定大鼠RPE细胞中血管内皮生长因子A（VEGFA）表达变化及细胞上清液中VEGFA质量浓度。结果成功构建2条大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体，病毒滴度分别为5×10^8TU／ml和3×10^8TU／ml，转染病毒后72h于荧光显微镜下观察RPE细胞慢病毒转染率均在70％以上。Lv—rSlit2-siRNAl组和Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2mRNA相对表达量分别为0．67±0．09和0．23±0．11，明显低于空白对照组的1．03±0．31和空病毒组的0．92±0．07；Lv—rSlit2-siRNAl组和Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2蛋白相对表达量分别为0．62±0．07和0．49±0．02，明显低于空白对照组的1．00±0．10和空病毒组的0．95±0．11，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。0、100、200和400μmol／LCoCl，作用后，空白对照组和Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFAmRNA的相对表达量明显不同，差异均有统计学意义（F浓度=127．998，P〈0．01；Fn自=69．663，P〈0．01），不同浓度CoCl2作用后各组大鼠RPE细胞中VEGFA蛋白相对表达量均明显不同，差异均有统计学意义（F浓度=17．059，P〈0．01；F分组=91．791，P〈0．01）。100、200和400μmol／LCoCl2作用后Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFAmRNA表达量及蛋白质量浓度均明显低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体构建成功并筛选出有效干扰重组序列，其能有效下调大鼠RPE细胞中Slit2基因的表达，并抑制缺氧环境下VEGFA在大鼠RPE细胞中的表达。