自体带Bruch膜视网膜色素上皮复合体移植治疗渗出性老年黄斑变性近期疗效观察

目的 探讨自体带Bruch膜视网膜色素上皮复合体移植术治疗渗出性老年性黄斑变性近期疗效.方法 回顾性分析30例确诊为渗出性老年性黄斑变性的患者,采用脉络膜新生血管膜切除联合自体带Bruch膜视网膜色素上皮复合体移植手术方法.手术前后行视力、荧光素眼底血管造影、吲哚氰绿眼底血管造影、多焦视网膜电图、光学相干断层扫描检查评价疗效.结果 移植术后随访6个月时,25例（83.33%）患者视力获得提高,2例（6.66%）患者视力不变,3例（10%）患者视力下降;所有患者黄斑区RPE植片平铺在位,未见CNV复发.结论 自体带Bruch膜视网膜色素上皮复合体移植治疗渗出性老年性黄斑变性近期疗效确切,是治疗渗出性老年性黄斑变性安全有效的手段之一.

补体C5b-9复合物对人视网膜色素上皮细胞TGF-β2表达的影响

目的观察补体C5b-9复合物对人视网膜色素上皮(RPE)细胞TGF-β2表达的影响。方法采用大鼠血清接触兔红细胞提取补体C5b-9复合物。提纯、鉴定后的补体C5b-9复合物作用于体外培养的人RPE细胞,用半定量RT-PCR法测量TGF-β2表达水平。结果补体C5b-9复合物刺激质量浓度为80μg/mL和40μg/mL时,光学显微镜示REP细胞结构破坏;低于或等于20μg/mL时,光学显微镜未见REP细胞结构明显改变。20μg/mL补体C5b-9复合物作用RPE细胞4h后,TGF-β2mRNA表达水平可提高2倍。结论补体C5b-9复合物对RPE细胞的破坏作用有溶破量和亚溶破量之分,亚溶破量可诱导RPE细胞TGF-β2表达上调。

血脂异常对小鼠视网膜色素上皮-玻璃膜-脉络膜毛细血管复合体影响的研究

目的探讨血脂异常C57BL小鼠视网膜色素上皮-玻璃膜-脉络膜毛细血管复合体(choriocapillario-Bruch′s membrane-retinalpig mente pitheliumcomplex,CBRC)的病理改变与年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,ARMD)的相关性。方法选C57BL小鼠36只,普通饲料喂养1周后按体重随机分为3月龄普通饲料组、8月龄普通饲料组和8月龄高脂饲料组。按时处死各组动物后作血液生化指标检测,同时摘取眼球做光镜和电镜病理切片观察。结果8月龄高脂饲料组血脂、血液流变学、丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)指标均高于3月龄、8月龄普通饲料组;8月龄高脂饲料组与3月龄、8月龄普通饲料组比较,色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)厚度明显变薄,玻璃膜厚度明显增厚。结论血脂异常能够加速C57BL小鼠的CBRC的病理改变,其改变与ARMD相似。

体外原代培养人视网膜色素上皮细胞(英文)

目的:探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术。为研究溶血磷脂酸(lysophos-phatidic acid, LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法:取自愿者贡献的意外事故成年眼球,用2.5g/L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养,细胞接近融合状态时进行传代培养。取自愿者贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞,用DMEM加100mL/L血清及MEM氨基酸和庆大霉素,进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF-β2)及LPA+TGF-β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验,用细胞染色法进行细胞计数,提取视网膜色素上皮细胞DNA,用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果:RPE原代细胞镜下为圆形,大小不一,内含较多的色素颗粒,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快,至4～5d即可基本融合,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛,细胞质内细胞器丰富,线粒体量多,体积较小,内外膜分界清晰,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内,多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。含有和/或缺乏10mL/L小牛血清的两种LPA(10μmol/L雪均明显刺激视网膜色素上皮细胞?

凝血酶对体外培养的视网膜色素上皮细胞生长的影响

目的 探讨凝血酶对视网膜色素上皮细胞的影响。 方法 利用体外培养的视网膜色素上皮细胞,观察不同浓度的凝血酶对视网膜色素上皮细胞的影响。 结果 各浓度的凝血酶对体外培养的视网膜色素上皮细胞具有促进增殖的作用,且40 U/ml尤为明显。结论凝血酶对体外培养的视网膜色素上皮细胞具有促进增殖的作用,这为探讨增生性玻璃体视网膜病变的发病机制提供了实验依据。

兔虹膜和视网膜色素上皮细胞的体外培养比较

目的 观察比较有色素兔虹膜色素上皮(IPE)及视网膜色素上皮(RPE)细胞的体外生长状况。方法采用酶消化法及酶辅助机械分离法分别分离IPE和RPE细胞。观察培养的两种细胞的生长状况,并对其进行免疫组化鉴定。结果原代IPE及RPE细胞大多呈圆形或六边形,细胞内充满了黑色素颗粒。随着传代的增加,呈梭形或纤维细胞样生长的细胞增多,细胞中的色素颗粒也逐渐减少。细胞角蛋白免疫组化染色显示IPE及RPE细胞绝大多数呈棕黄色阳性反应。Desmin免疫组化染色显示IPE细胞中阳性细胞约占5％。 结论 分离培养的IPE和RPE细胞纯度很高,IPE细胞中绝大多数为后层IPE细胞。IPE和RPE细胞的形态及体外生长特点类似。

基质细胞衍生因子-1α对体外培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响研究

目的:研究基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived fac-tor-1α,SDF-1α)对体外培养的人类视网膜色素上皮(hu-man retinal pigment epithelium,hRPE)细胞增殖的影响。方法:应用MTT法研究SDF-1α对体外培养的人RPE细胞增殖的影响;用细胞化学染色法检测添加SDF-1α前后人视网膜色素上皮细胞内细胞增殖核抗原(proliferatingcell nucler antigen,PCNA)的表达情况。结果:MTT法表明SDF-1α可促进体外培养的hRPE细胞的增殖(P<0.05);细胞化学电镜下观察发现:添加SDF-1α前hRPE细胞未表达或低表达PCNA,而添加SDF-1α后细胞高度表达PCNA。结论:细胞因子SDF-1α可促进体外培养的hRPE细胞增殖。

过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的上调作用

目的:探讨过氧化氢诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的影响。方法:分别选择0,100,300μmol/L过氧化氢作用ARPE-19细胞4h后收集样本,Western blot方法检测细胞中20S蛋白酶体表达水平,细胞免疫荧光方法检测20S蛋白酶体在细胞中的分布。结果:100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞中20S蛋白酶体的表达和对照组相比明显增加(100μmol/L过氧化氢处理组vs0和300μmol/L过氧化氢处理组,P<0.05),并呈现剂量依赖性。正常培养情况下,细胞内20S蛋白酶体在核周微量表达,100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞内20S蛋白酶体和对照组相比明显增加,其分布集中在核内及核膜周围。结论:过氧化氢对ARPE-19的20S蛋白酶体表达有上调作用。

玻璃体条件培养液对人视网膜色素上皮细胞生长活性及细胞周期的影响

目的:探讨在含有人玻璃体的条件培养液作用下体外培养的人视网膜色素上皮(HRPE)细胞形态学、细胞生长活性及细胞周期的改变。方法:将HRPE细胞培养在含100,250,500,1000mL/L人玻璃体的DMEM条件培养液(VCM)。用倒置显微镜观测细胞的形态学改变,分别用MTT、流式细胞术检测细胞的生长活性及细胞周期的改变。结果:不同体积分数的VCM使HRPE细胞的形态发生了改变,HRPE细胞出现了多核及更早的脱色素,类似成纤维细胞表型的生长状态。含100,250及500mL/L玻璃体体积的VCM处理后HRPE细胞的增长活性与对照组相比存在显著性差异(P均<0.01),其中含250mL/L玻璃体的VCM刺激HRPE细胞增生的能力最强。VCM促使更多的HRPE细胞进入了DNA合成期(S期,6%～13%),含250与500mL/L玻璃体体积的VCM使HRPE细胞出现了异倍体的改变。结论:一定体积分数的VCM使HRPE细胞的S期比例增加,细胞增生能力增强。

人胚胎视网膜色素上皮细胞的体外培养和吞噬作用

目的探讨人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞分离培养的特性及其吞噬作用。方法取发育至13～15周的新鲜人胚胎眼球,显微解剖后采用机械胰酶消化法分离培养RPE细胞,应用免疫荧光法观察人胚胎RPE细胞吞噬视网膜光感受细胞外节膜盘。结果人胚胎发育至13～15周后,RPE细胞可应用标准的培养方法进行体外培养和传代。根据测定的人胚胎RPE细胞生长曲线,取2～6代细胞用于实验培养的人胚胎RPE细胞具备吞噬功能。结论改进了人胚胎RPE细胞的培养方法,证明人胚胎RPE细胞在体外具有吞噬能力。

人脐带间充质干细胞外泌体保护人视网膜色素上皮细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡

目的人脐带间充质干细胞(hUMSCs)外泌体在保护人视网膜色素上皮(RPE)细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡中的作用。方法实验研究。超速离心法收集hUMSCs外泌体,通过透射电镜和纳米颗粒追踪分析其形态结构;采用CCK-8和EdU实验检测外泌体处理后的人RPE在高糖条件下的增殖情况;通过蛋白免疫印迹(western blot)检测周期蛋白和凋亡蛋白的变化;运用流式细胞仪检测hUMSCs外泌体在高糖诱导凋亡率中的作用。结果高浓度糖培养环境通过促进线粒体介导的细胞凋亡而抑制了ARPE-19的增殖;来自hUMSCs的外泌体(hUMSC-exo)能促进人RPE细胞的增殖及保护ARPE-19抵抗高糖诱导的细胞凋亡。结论hUMSCs外泌体能够保护人RPE细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡。

视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的机制研究

目的探讨视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的分子机制。方法将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞分为空白组、高糖组。将人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)分为NG组、HG组、NG+外泌体组和HG+外泌体组。空白组、NG组和NG+外泌体组细胞用含5.5 mmol·L^(-1)正常浓度葡萄糖的培养基培养24 h;高糖组、HG组和HG+外泌体组细胞用含30 mmol·L^(-1)高浓度葡萄糖的培养基培养24 h;NG+外泌体组和HG+外泌体组细胞在培养基中分别加入空白组或高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体40μg·L^(-1)。PKH67绿色荧光标记外泌体;利用CCK-8法、Transwell小室法检测HRMECs增殖、迁移和血管生成。取空白组和高糖组ARPE-19细胞外泌体进行miRNA微阵列分析。采用双荧光素酶报告分析检测miR-4488和转化生长因子β受体Ⅱ(TGFβR2)基因序列的靶向关系。采用Western blot或免疫荧光染色检测各组HRMECs中TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467或Desmin、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的被PKH67标记的外泌体加入培养基后都可被HRMECs吸收。与NG组相比,HG组HRMECs细胞增殖率、迁移率、血管结点数和血管总长度、TGFβR2和p-Smad2ser467蛋白表达量、Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均增加(均为P<0.05);与HG组相比,HG+外泌体组上述指标均被逆转(均为P<0.05);NG+外泌体组与NG组上述指标相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与空白组相比,高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体中miR-4488相对表达量增加,且miR-4488模拟物和TGFβR2wt共转染可增加双荧光素酶活性(均为P<0.05)。结论在高糖条件下,ARPE-19细胞释放的外泌体可通过miR-4488/TGFβR2/Smad信号通路抑制HRMECs间充质转化。

维生素E对大剂量蓝光诱导损伤视网膜色素上皮细胞的影响

目的:研究维生素E(Vit E)对大剂量蓝光诱导人视网膜色素上皮(hRPE)细胞损伤的影响,为减少蓝光损伤hRPE细胞的预后方案提供思路。方法:用3000±150Lx蓝光建立hRPE细胞损伤模型;利用流式细胞术检测照射时间分别为0、3、6、9、12、24h的6组hRPE细胞凋亡率及活性氧相对量;利用流式细胞术检测照射0h组、照射6h组、照射6h前或后加不同浓度Vit E组(Vit E的浓度分别为10、50、100μmol/L)的hRPE细胞凋亡情况和活性氧相对量,并采用Hoechst 33258试剂染色在荧光显微镜下观察hRPE细胞的荧光强度。结果:与照射0h组相比,照射3、6、9、12、24h组的hRPE细胞活性氧相对量明显增加(均P<0.01),照射6、9、12、24h组的hRPE细胞凋亡率也明显增加(均P<0.01),但照射3h组的hRPE细胞凋亡率无明显增加,差异无统计学意义(P=0.46)。与照射6h组相比,除照射6h前加入10μmol/L的hRPE细胞凋亡率(P=0.66)外,其他加Vit E的实验组hRPE细胞活性氧相对量和凋亡率明显减少、细胞中Hoechst 33258释放蓝色荧光逐渐减弱,且呈浓度依赖(均P<0.01)。与照射0h组相比,加Vit E的6组hRPE细胞活性氧相对量和凋亡率有差异(均P<0.01)。同一浓度的Vit E,除10μmol/L Vit E的hRPE细胞凋亡率在照射前或后加无差异(P=0.08)外,照射后加Vit E组比照射前加Vit E组的hRPE细胞活性氧相对量、凋亡率明显减少(均P<0.01)。结论:hRPE细胞经蓝光照射后出现胞内活性氧相对量增多的现象早于细胞凋亡,清除胞内活性氧是减少大剂量蓝光诱导hRPE细胞损伤的思路。Vit E可保护由大剂量蓝光诱导的RPE细胞损伤,这种效应随Vit E浓度增加而增强,且照射后加入比照射前加入的效果更好。但需要一定剂量的Vit E才能显效,而且无法完全修复损伤。

人Müller细胞来源的外泌体对脂多糖刺激视网膜色素上皮细胞产生炎症因子的影响

目的研究人原代Müller细胞来源的外泌体(EXO)对脂多糖(LPS)刺激人视网膜色素上皮(RPE)细胞产生炎症因子的影响。方法原代纯化培养人Müller和RPE细胞,通过免疫荧光鉴定RPE细胞,用试剂盒提取得到Müller细胞来源的EXO并通过透射电镜观察和Western印迹法进行鉴定。在无EXO培养基培养人RPE细胞后,分别采用100 ng/mL LPS刺激,不加或加入EXO(50μg/mL),以不含EXO和LPS培养细胞为对照组,分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定和实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究RPE细胞产生炎症因子的变化。结果人Müller细胞来源的提取物经透射电镜观察为圆形或半圆形囊泡,直径为30~100 nm,表达EXO特有标志物CD63和Flotillin-1。LPS组上清液中白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度分别为(333.89±41.51)、(404.67±13.88)、(1 557.11±317.08)、(466.78±39.34)μg/mL,EXO+LPS组分别为(214.11±18.14)、(318.12±34.73)、(1 170.37±244.15)、(319.73±41.39)μg/mL,2组比较差异有统计学意义(IL-1β:P<0.01;IL-6、IL-8:P<0.05;TNF-α:P<0.001)。与LPS组相比,EXO+LPS组的相关基因表达受到抑制,其中IL-1β基因表达差异有统计学意义(P<0.05),IL-8、CCL20和TNF-α差异有统计学意义(P<0.001),CCL2与IL-6则组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功获得Müller来源的EXO,其对LPS刺激RPE细胞产生炎症因子具有一定的调节作用。

人胚视网膜色素上皮细胞的培养和超微结构观察

目的 分析人胚眼视网膜色素上皮 (RPE)细胞的生物学特性。方法 酶分层消化法分离培养RPE细胞 ,原代细胞分别计算贴皿率、伸展率和生长率。传代细胞计算分裂时间和总分裂次数。结果 人胚RPE细胞贴皿率为85 7%± 5 2 % ,伸展率为 84 2 %± 4 8% ,生长率为 72 2 % ;成人RPE细胞的贴皿率为 79 4%± 8 3 % ,伸展率为80 3 %± 6 7% ,生长率为 63 8%。人胚RPE细胞的分裂时间 (DOT )为 1 5 8d ,总分裂次数 (PD)为 4 43 ;成人RPE细胞的分裂时间 1 91d ,总分裂次数为 3 66。

培养人视网膜色素上皮细胞中β-半乳糖苷酶活性研究

目的 观察培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞中复制衰老相关的 β 半乳糖苷酶活性。 方法 在培养的RPE细胞中 ,以传代次数 ( 5、10、2 0 )和取材供体的年龄 ( 2 6、44、5 7岁 )分组 ,进行标准化的 β 半乳糖苷酶活性和细胞增殖能力检测。结果 培养RPE细胞中 β 半乳糖苷酶活性阳性细胞数量随传代次数的增加而增加 ,在 2 0代的细胞中 ,阳性细胞的数量为 87%± 1 2 % ,明显高于第 5代和第 10代细胞 (P <0 0 5 )。而细胞的增殖能力明显下降 (P <0 0 5 )。结论 培养RPE细胞复制衰老的发生与细胞传代次数和取材年龄相关 。

灵杞黄斑颗粒含药血清对兔视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨灵杞黄斑颗粒含药血清对体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化损伤的保护作用。方法:运用血清药理学方法制备灵杞黄斑颗粒含药血清,用过氧化氢(500μmol/L)诱导RPE细胞建立体外氧化应激模型。实验分为正常对照组、模型组、空白血清组、低剂量药物血清组和高剂量药物血清组。分别采用原位末端转移酶标记技术(teminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)和流式细胞仪对各组RPE细胞的凋亡进行检测,并采用蛋白质印迹法检测各组细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)及Bcl-XL蛋白表达的变化。结果:流式细胞仪检测结果显示,正常对照组、模型组、空白血清组、低剂量药物血清组、高剂量药物血清组各组凋亡率分别为(4.85±0.26)%、(20.02±1.37)%、(21.84±0.94)%、(13.56±0.55)%、(8.58±0.39)%;含药血清组的凋亡率比模型组明显减少(P<0.05)。TUNEL检测结果显示,凋亡细胞核呈现黄色着染,低剂量药物血清组中散见凋亡细胞,数量明显少于模型组,高剂量药物血清组中凋亡细胞进一步减少。Caspase-3和Bcl-XL表达检测显示,模型组caspase-3蛋白表达上调,高于高剂量药物血清组(P<0.05);而Bcl-XL蛋白表达下调,显著低于低剂量药物血清组和高剂量药物血清组(P<0.01)。结论:灵杞黄斑颗粒含药血清对兔RPE细胞氧化损伤具有一定的保护作用,该作用可能是通过清除自由基,下调caspase-3并上调Bcl-XL的表达实现的。

视网膜色素上皮移植最新进展

视网膜色素上皮细胞移植是近年治疗视网膜变性疾病的一个引人注目的领域。目前视网膜色素上皮移植技术已逐步应用于临床。现就视网膜色素上皮细胞移植的供体材料选择、受体要求、目的基因导入及其临床应用的最新进展作一综述。

视网膜色素上皮细胞来源外泌体与老年性黄斑病变

老年性黄斑病变(age-related macular degeneration,AMD)也被称为年龄相关黄斑变性、增龄性黄斑变性。多双眼发病,病发时一般双眼先后或同时发病,出现中心暗点、视物变形等视觉障碍,多发生在50岁以上的中老年中,且感染几率会随着年龄的增长而增加,成为导致当今中老年失明的重要原因。眼科领域普遍认为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞分泌的外泌体很可能参与AMD的发生与发展。RPE细胞通过分泌携带内容物的外泌体,将其转移到邻近或远处细胞,完成细胞间的信息交流,并对细胞造成一定程度的影响,参与细胞生长与转移、血管生成,在免疫调节、炎症反应等诸多病理生理过程中发挥重要作用。在对RPE细胞外泌体进行深入研究的同时,也发现了外泌体对AMD早期诊断和治疗的新潜力,为AMD的研究带来了新的方向。