LED光源照射及PI3K抑制剂对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨LED光源照射对人视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬和凋亡的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002在光照下对RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法体外培养人ARPE-19细胞,随机分为6 h对照组、6 h模型组、6 h LY294002组,12 h对照组、12 h模型组、12 h LY294002组,24 h对照组、24 h模型组、24 h LY294002组,分别给于设定时间的LED冷光照射或加入LY294002后的光照。采用噻唑蓝法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;透射电子显微镜观察各组细胞超微结构;构建稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(LC3)的RPE细胞株,激光共聚焦合倒置荧光显微镜分析细胞自噬流变化;Western blot法检测苄氯素1(Beclin 1)、LC3和p62自噬相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,6、12、24 h模型组细胞存活率均下降(均P<0.05),12、24 h LY294002组细胞存活率均下降(均P<0.01);与模型组比较,12、24 h LY294002组细胞存活率均升高(均P<0.05)。与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞凋亡率均升高(均P<0.05);与模型组比较,6、12 h LY294002组细胞凋亡率均下降(均P<0.05)。模型组RPE细胞在光照24 h后,胞内可见较多的自噬泡,LY294002干预后也可见聚集性分布的自噬囊泡。观察自噬流发现,对照组少见红色亮点,模型组红色亮点荧光随光照时间延长数量逐渐增多,Merge图中黄色亮点数量增多明显,LY294002干预后,红色亮点与黄色亮点呈增多趋势。与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平均升高,p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,6、12、24 h LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达均升高,12、24 h LY294002组细胞中p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论LED光源照射可刺激ARPE-19细胞发生自噬,增加细胞凋亡率;PI3K抑制剂LY294002能上调细胞的自噬活性,减缓凋亡。

雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞自噬的影响

目的:探讨雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)自噬的影响。方法:将自噬双标mRFP-eGFP-LC3质粒转染进ARPE-19细胞中获得稳定表达的转染细胞株,随后随机分为6 h对照组、6h模型组、6 h雷帕霉素组;12 h对照组、12 h模型组、12 h雷帕霉素组和24 h对照组、24 h模型组、24 h雷帕霉素组。对照组避光培养,模型组受光照刺激;雷帕霉素组加入10μmol/L雷帕霉素后受光照刺激,光源采用LED冷光灯,在(16500±500)lx光照强度下照射细胞6、12、24 h。检测转染效率,MTT检测ARPE-19细胞存活率;激光共聚焦显微镜对自噬流变化进行定性分析,透射电镜观察细胞自噬形态;蛋白免疫印迹法对Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白表达量进行检测。结果:与对照组相比,模型组光照6、12、24 h后,细胞存活率显著下降(P<0.001);雷帕霉素组经光照后细胞存活率高于模型组(P<0.05)。光照6、12、24 h后模型组红色荧光斑点较对照组逐渐增多,绿色荧光斑点也随之增加,Merge图中从光照12 h开始黄色斑点数量增多明显。雷帕霉素组在光照6、12、24 h时红色荧光斑点较模型组加强,绿色荧光较模型组弱。透射电镜观察发现模型组胞内见较多的自噬泡,雷帕霉素组细胞见大量聚集分布自噬囊泡。蛋白免疫印迹结果发现光照6、12、24 h后,模型组中自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的相对表达水平均增加,P62蛋白表达较低。而采用雷帕霉素干预后,与模型组相比,雷帕霉素组在光照6 h时Beclin 1蛋白表达量差异不明显、在12、24h时Beclin 1蛋白表达量逐渐升高;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均高于模型组;P62蛋白表达量差异不显著。结论:光照可诱导ARPE-19细胞自噬现象的发生,且雷帕霉素能上调其自噬活性。

黄芪皂苷通过调控蛋白激酶R样内质网激酶途径抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬的研究

目的:探讨黄芪皂苷通过调控蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)途径影响高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)自噬水平。方法:体外培养人视网膜色素上皮细胞,实验分为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(30 mmol/L葡萄糖),黄芪皂苷组(30 mmol/L葡萄糖+2.5、5、10μg/mL黄芪皂苷)。噻唑蓝比色(MTT)法检测ARPE-19细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测自噬相关蛋白及PERK途径关键因子表达水平。添加PERK特异性抑制剂GSK2606414,Western blot检测对细胞自噬水平的影响。结果:与正常对照组比较,高糖组ARPE-19细胞活性降低,凋亡率升高,自噬相关蛋白LC3表达水平明显升高,另一自噬相关蛋白p62蛋白表达水平明显降低。PERK途径关键因子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Perk和增强子结合蛋白的同源蛋白(CHOP)表达水平明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。与高糖组比较,黄芪皂苷组ARPE-19细胞活性升高,凋亡率降低,LC3蛋白表达水平明显下调,p62蛋白表达水平明显上调,GRP78、Perk和CHOP蛋白水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。PERK特异性抑制剂GSK2606414能够进一步抑制黄芪皂苷组ARPE-19细胞LC3蛋白表达水平,上调p62蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:黄芪皂苷能够抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬水平,其作用机制可能与抑制蛋白激酶R样内质网激酶途径有关。

紫外线B照射在抑制人视网膜色素上皮细胞自噬中的作用

目的探讨紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射在抑制人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19细胞自噬中的作用。方法不同剂量UVB照射ARPE-19细胞后不同时间收集细胞,应用MTT法检测UVB照射对细胞存活的影响;Western blot检测细胞中自噬蛋白LC3的表达及LC3-II/LC3-I比率、Beclin-1蛋白表达水平;应用细胞自噬增强剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和细胞自噬抑制剂氯化铵(NH4Cl)进一步验证UVB照射对于细胞自噬的调节;采用环氧霉素(epoxomicin,EPO)检测泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)对于UVB作用的影响。MTT法检测细胞自噬变化对于细胞生存的影响。结果UVB照射组诱导细胞剂量依赖性的死亡,100 mJ·cm^(-2) UVB照射后24 h细胞出现明显死亡,和对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);200 mJ·cm^(-2) UVB照射后24 h和对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01);两种剂量的UVB照射后48 h细胞有一定程度的恢复。和对照组相比,UVB照射组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表达水平均降低(均为P<0.05)。和UVB照射组相比,UVB+RAPA组ARPE-19细胞中明显升高了LC3-II/LC3-I比率,UVB+NH4Cl组进一步降低了LC3-II/LC3-I比率,RAPA和NH4Cl在一定程度上恢复了UVB照射降低的Beclin-1蛋白表达水平(均为P<0.05)。和对照组相比,EPO组明显增加了ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率、升高了Beclin-1蛋白表达水平(均为P<0.05)。与UVB照射组相比,UVB+EPO组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率无明显改变(P>0.05),而Beclin-1蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,RAPA组细胞死亡率增多,两组间差异有统计学意义(P<0.05),NH4Cl组细胞无明显死亡,与UVB照射组相比,UVB+RAPA组和UVB+NH4Cl组细胞死亡率均无明显改变(均为P>0.05)。细胞自噬的改变不能逆转UVB诱导的ARPE-19细胞死亡。结论UVB照射抑制了ARPE-19细胞自噬的启动及自噬流,UPS的改变不影响UVB对于自噬流的抑制。UVB照射可通过减少RPE细胞、损害细胞自噬能力增加RPE细胞变性,增加年龄相关性黄斑变性发生的风险。

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

目的探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组。对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-19细胞置于含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基中孵育12 h;3-MA组:使用含10 mmol·L^(-1)3-MA(美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用正常DMEM-F12完全培养基孵育细胞12 h;3-MA联合A2E组:先使用10 mmol·L^(-1)3-MA预处理细胞1 h,再将细胞放入含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育12 h。使用CCK\|8法检测各组ARPE-19细胞增殖情况,透射电镜观察各组ARPE-19细胞超微结构,Western blot法检测各组ARPE-19细胞Beclin-1和P62自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色法检测各组ARPE-19细胞自噬标志物LC3蛋白的表达,使用Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液10种细胞因子表达情况,10种细胞因子包括:细胞间黏附分子、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL^(-1)0、血管生成素2、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子和VEGFA。结果与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞生存率下降了27.16%(P<0.01)。与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞培养上清液10种细胞因子含量均明显升高(均为P<0.01)。与对照组相比,3-MA组ARPE-19细胞超微结构无明显变化,而A2E组ARPE-19细胞胞浆内出现大量自噬泡;3-MA联合A2E组ARPE-19细胞自噬泡数量较A2E组明显减少。3-MA联合A2E组ARPE-19细胞胞浆内可见荧光斑点亮度较A2E组减弱,绿色荧光斑点数量也明显减少。与对照组相比,A2E组ARPE-19细胞Beclin-l蛋白相对表达量显著升高(P<0.001),P62蛋白的相对表达量显著降低(P<0.001)。与A2E组相比,3-MA联合A2E组ARPE-19细胞中Beclin-l蛋白相对表达量显著降低(P<0.01,),而P62蛋白相对表达量显著升高(P<0.001)。结论3-MA联合A2E作用下,ARPE-19细胞中炎症因子和血管生长因子的表达显著升高,自噬溶酶体数量及自噬蛋白的表达降低,自噬在年龄相关性黄斑变性的发生和发展中具有重要的调节作用。

枸杞多糖对H_2O_2诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及Beclin-1、LC3B表达的影响

目的:探讨枸杞多糖(LBP)对H_2O_2诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)自噬及对Beclin-1、LC3B表达的影响。方法:将ARPE-19细胞用不同浓度H_2O_2处理后应用透射电镜观察H_2O_2对ARPE-19细胞自噬的影响,蛋白质印迹法检测不同浓度的LBP对H_2O_2诱导ARPE-19细胞Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达的影响。结果:H_2O_2诱导ARPE-19细胞12 h后,与对照组比较,H_2O_2600μmol·L-1组自噬表达显著增加。H_2O_2诱导后,ARPE-19细胞Beclin-1和LC3BⅠ、LC3BⅡ表达显著升高,LC3BⅡ/LC3BⅠ值升高(P <0.01)。1 000μg·m L-1LBP+400μmol·L-1H_2O_2组Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达显著降低(P <0.01)。结论:枸杞多糖能够降低Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达,干预H_2O_2诱导所致ARPE-19细胞的自噬水平升高,干预效应在浓度为1 000μg·m L-1时最为显著。

脂褐素成分A2E诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及损伤的研究

目的探讨N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(A2E)能否诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)的自噬及损伤反应,并从自噬的角度探索其与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病相关的分子机制。方法CCK-8法筛选A2E作用于ARPE-19细胞的最佳浓度用于后续实验。采用多重细胞因子检测技术检测A2E作用于ARPE-19细胞后对细胞间黏附分子(ICAM)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、促血管生成素-2(Ang-2)、胎盘生长因子(PIGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)以及血管内皮生长因子A(VEGFA)表达的影响,透射电子显微镜观察ARPE-19细胞超微结构的变化,免疫荧光标记检测细胞内自噬相关蛋白LC3的表达变化,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达变化。结果依据CCK-8法检测结果,选择20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞用于后续实验。20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞后,细胞因子ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、IGF-1、TGF-β的表达水平自6 h起均有所升高,PIGF和VEGFA的表达水平在A2E作用12 h后也明显升高,与未给予A2E处理的对照相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。透射电子显微镜下可见,20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞1 h后细胞质内可见碗状、尚未收口的双层膜结构的“吞噬泡”,作用3 h、6 h、12 h时出现自噬体结构以及自噬溶酶体结构,自噬囊泡在A2E作用24 h时开始出现内容物减少,体积逐渐缩小。荧光显微镜下可见,与未给予A2E处理的对照相比,20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞6 h起即可见细胞质内LC3荧光呈现点状聚集,至12 h时荧光斑点数量达到最多、颗粒也最大、差异最明显,24 h时绿色荧光斑点数量开始下降,荧光强度也较前减弱。Western blot检测结果显示,与未给予A2E处理的对照相比,ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白的表达在A2E作用1 h、3 h、6 h、12 h及24 h时均显著升高,p62蛋白的表达在A2E作用1 h、3 h、6 h、12 h及24 h时均下降(均为P<0.05)。结论A2E能够刺激ARPE-19细胞分泌多种AMD相关炎症因子和新生血管因子,同时也能激活自噬潮,这为进一步研究自噬在AMD发病中扮演的角色提供了新的思路。

人脐带间充质干细胞对高浓度葡萄糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬水平的影响及其机制

目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,hUMSCs)对高糖环境下人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19)细胞自噬水平的影响及可能的机制。方法原代培养hUMSCs,蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定其CD90蛋白的表达。根据不同干预将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组和高糖+hUMSCs组。对照组细胞在无糖培养基中培养,高糖组细胞在培养基中加入25 mmol/L D-葡萄糖(D-glucose)培养,高糖+hUMSCs组将hUMSCs与高糖损伤的ARPE-19细胞Transwell共培养。培养24 h后,采用电镜观察三组细胞内自噬体的超微结构,利用噻唑兰实验(MTT)检测各组RPE细胞增殖水平,Western blot检测各组细胞的细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-related protein 1 light chain 3B,LC3B)Ⅱ型和Ⅰ型的比值(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ)、Beclin-1、P62及信号通路蛋白mTOR、p-mTOR的表达,酶联免疫吸附试验检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的含量。结果hUMSC的表面标志蛋白CD90呈阳性表达。高糖+hUMSCs组中自噬体的数量明显少于高糖组。与高糖组相比,高糖+hUMSCs组细胞增殖率明显升高(77.82%±3.26%vs 85.19%±2.22%,P=0.007)。与对照组相比,高糖组和高糖+hUMSCs组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1表达显著增加(均P<0.05),P62的表达显著降低(均P<0.01)。与高糖组比较,高糖+hUMSCs组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1表达明显降低(均P<0.01),P62表达明显增加(P<0.01),p-mTOR值也明显升高(P<0.01)。相较于高糖组,高糖+hUMSCs组VEGF的质量浓度明显降低(P=0.001)。结论hUMSCs通过激活mTOR信号通路抑制糖尿病视网膜病变中ARPE-19细胞的自噬水平。

硫氧还蛋白对糖尿病视网膜色素上皮细胞自噬的影响

糖尿病视网膜病变是糖尿病主要的并发症之一。近年发现,自噬功能紊乱与糖尿病视网膜病变存在较为密切的关系。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一类小分子蛋白,有促进细胞增殖、抗氧化、抗凋亡等作用,并且其表达降低可能是DR发生的关键因素之一。本研究利用高糖模拟人体糖尿病视网膜病变环境培养人视网膜色素上皮细胞(ARPE19),探究Trx对高糖环境下RPE细胞自噬作用的影响及相关机制,为临床治疗和预防糖尿病视网膜病变提供新的靶点和理论依据。

自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组:使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:使用含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组:使用含100 nmol·L^(-1)雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组:使用100 nmol·L^(-1)雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测各组细胞自噬标志物LC3蛋白的表达。结果与对照组相比,A2E组细胞生存率显著下降(P<0.001),而雷帕霉素联合A2E组细胞生存率得到了部分恢复,与A2E组相比差异有统计学意义(P<0.01)。与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中10种细胞因子含量均有所下降(均为P<0.01)。与对照组相比,雷帕霉素组细胞内出现散在自噬囊泡,A2E组细胞内出现较多的自噬囊泡,而雷帕霉素联合A2E组细胞内出现大量聚集的大体积的自噬囊泡。与对照组相比,A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.001),P62蛋白相对表达量显著降低(P<0.001);与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量明显升高(P<0.01),而P62蛋白相对表达量明显降低(P<0.001)。雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞内LC3蛋白的绿色荧光斑点大量聚集,与A2E组相比荧光强度增加,斑点体积更大,数量也更多。结论雷帕霉素能够进一步激活A2E诱导的ARPE-19细胞自噬活性,一定程度上降低了A2E对RPE细胞造成的损伤,并抑制了ARPE-19细胞中炎症因子和血管生成因子的分泌。

Notch1和自噬对高糖诱导下的人视网膜色素上皮细胞的作用

目的观察高糖条件下Notch1与自噬之间的关系,并探讨Notch1抑制剂DAPT和自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人视网膜色素上皮细胞的影响。方法预实验选定25 mmol·L^(-1)葡萄糖作为ARPE-19细胞的高糖培养液,5 mmol·L^(-1)3-MA作为自噬抑制剂浓度。将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组(添加5 mmol·L^(-1)葡萄糖培养48 h)、高糖组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖培养48 h)、高糖+DAPT组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖+40μmol·L^(-1)DAPT,40μmol·L^(-1)DAPT先处理2 h,然后更换25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理48 h)及高糖+3-MA组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖+5 mmol·L^(-1)3-MA,5 mmol·L^(-1)3-MA处理2 h,然后更换25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理48 h)。采用透射电镜观察各组细胞超微结构;CCK-8和划痕实验检测各组细胞增殖和迁移情况;Western blot检测各组细胞Notch1和自噬相关蛋白LC3、Beclin1的蛋白表达情况;RT-PCR法检测各组细胞中Notch1、LC3、Beclin1的mRNA相对表达量。结果透射电子显微镜下对照组细胞结构正常,核呈圆形或卵圆形,自噬小体少量可见;高糖组细胞损伤略微明显,胞质不均且可见较多自噬溶酶体。与对照组相比,高糖组细胞增殖、迁移能力均上升,Notch1、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均增高(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+DAPT组细胞增殖、迁移能力均下降,Notch1、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均降低(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+3-MA组细胞增殖、迁移能力均下降,LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均降低(均为P<0.05)。结论高糖可激活Notch1和自噬过程并促进ARPE-19细胞的增生,而Notch1抑制剂DAPT和自噬抑制剂3-MA在一定程度上可抑制自噬的进程,发挥抑制细胞增生的作用。

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

基于网络药理学的银杏叶提取物修复蓝光损伤视网膜色素上皮细胞的机制

目的探讨银杏叶提取物修复蓝光损伤视网膜色素上皮细胞的作用机制。方法用网络药理学方法获取银杏叶提取物的活性组分、二级结构及其作用靶点、疾病作用靶点、构建蛋白互作关系网络、筛选出关键蛋白,并进行富集分析。体外细胞实验检测蓝光损伤视网膜色素上皮细胞添加银杏叶提取物后细胞活性、细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)相对量和miR-103a-3p mRNA表达量。结果查得银杏叶提取物20种活性组分、61个对视网膜色素上皮病变的潜在作用靶点,富集分析发现潜在作用靶点基因本体主要富集到BP,京都基因与基因组百科全书主要富集到脂质和动脉粥样硬化通路等。体外实验发现,银杏叶提取物可以提高蓝光损伤后视网膜色素上皮细胞活性,减少ROS相对量,高剂量的银杏叶提取物可以降低miR-103a-3p mRNA表达(P均<0.05)。结论银杏叶提取物可能通过作用于肿瘤坏死因子、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、前列腺素内过氧化物合成酶Ⅱ等9个靶点,调节脂质与动脉粥样硬化通路、癌miRNA(microRNAs in cancer)通路等,抑制视网膜色素上皮细胞的细胞死亡、氧化代谢等,从而修复视网膜色素上皮细胞蓝光损伤。

阿魏酸改善高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的研究

目的 通过观察阿魏酸(FA)对高糖(HG)诱导视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的影响,探讨FA对糖尿病视网膜病变的作用机制。方法 采用HG处理ARPE-19构建体外糖尿病视网膜色素上皮细胞损伤模型,FA溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,分为Control组(5 mmol/L葡萄糖)、DMSO组(0.1%DMSO+5 mmol/L葡萄糖)、HG组(30 mmol/L葡萄糖)、HG+FA组(30 mmol/L葡萄糖+50μmol/L)。通过CCK-8检测细胞的增殖活性;采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组ROS水平;免疫细胞荧光和Western blot检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子(MyD88)、核因子κB(NF-κB)的表达水平。结果 CCK-8检测结果表明,与Control组相比,HG可诱导ARPE-19细胞的增殖活性降低,而FA可改善高糖对细胞增殖的影响(P<0.05)。ROS检测结果表明,与Control组相比,HG组可诱导ARPE-19细胞ROS荧光强度升高,FA可显著降低高糖诱导ARPE-19细胞的ROS荧光强度(P<0.05)。免疫细胞荧光和Western blot实验表明,HG组可诱导ARPE-19细胞TLR4、MyD88、NF-κB表达升高,FA可显著降低它们的表达(P<0.05)。结论 FA通过降低ROS产生和下调TLR4、MyD88、NF-κB表达改善高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤。

枸杞提取物对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的:体外通过过氧化氢(H2O2)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞造成氧化损伤,观察枸杞提取物对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞活性的影响,探讨枸杞提取物通过抗氧化对ARPE-19细胞的保护作用。方法:采用不同浓度H2O2诱导体外ARPE-19细胞的氧化损伤,确定最佳浓度;采用MTT法检测枸杞含药血清对ARPE-19细胞活力的影响,确定安全有效的药物浓度;观察各组细胞的形态,划痕试验检测各组ARPE-19细胞的活力;Western Blot法检测各组细胞Nrf2/ARE信号通路相关因子Nrf2的质蛋白和核蛋白的表达水平;试剂盒检测氧化应激水平的相关指标活性氧(ROS)含量、还原型谷胱甘肽(GSH)含量及过氧化氢酶(CAT)活力。结果:当H2O2浓度为200μmol/L,作用2 h时,ARPE-19细胞出现明显的氧化损伤(P<0.01);不同浓度的枸杞含药血清对ARPE-19细胞的干预效果不同,在2.5%、5%、10%的浓度下对损伤的ARPE-19细胞具有明显的促进增殖的作用(P<0.05),故选择2.5%、5%、10%浓度的枸杞含药血清进行下一步实验,与模型组相比,枸杞含药血清组细胞形态良好,长势均匀;细胞内的ROS含量显著降低(P<0.01),GSH含量明显上升(P<0.05),CAT活力显著升高(P<0.01);Nrf2质蛋白表达增强(P<0.05),核蛋白表达减弱(P<0.05)。结论:枸杞含药血清能够提高ARPE-19细胞自身的抗氧化能力,从而对ARPE-19细胞产生保护作用。

DRP1调控线粒体稳态对人视网膜色素上皮细胞上皮-间充质转化的影响

目的探讨线粒体动力相关蛋白(DRP1)对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞上皮-间充质转化(EMT)进程的影响。方法构建H_(2)O_(2)干预ARPE-19细胞模型,将ARPE-19细胞分为3组,NG组:采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞6 h;H_(2)O_(2)组:先采用650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预细胞,此后培养方式及时间与NG组相同;H_(2)O_(2)+Mdivi-1组:先采用10μmol·L^(-1)Mdivi-1处理ARPE-19细胞2 h,再给予650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预,此后培养方式及时间与NG组相同。Western blot检测各组细胞p-DRP-1/DRP1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波型蛋白(Vimintin)及紧密连接蛋白(ZO-1)表达水平;线粒体红色荧光探针检测各组细胞线粒体形态;线粒体超氧化物红色荧光探针检测各组细胞线粒体活性氧(ROS)水平;JC-1染色试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位;免疫荧光检测各组细胞中ZO-1表达水平。结果H_(2)O_(2)组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值高于NG组,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值低于H_(2)O_(2)组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞较H_(2)O_(2)组线粒体碎片化程度得到改善。H_(2)O_(2)组细胞线粒体ROS水平(4.42±0.29)与NG组(1.00±0.17)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(2.15±0.18)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞红/绿荧光强度比值(0.16±0.12)与NG组(1.00±0.09)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(0.42±0.05)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞上皮样标志物表达下降,间质样标志物表达上升,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞上皮样标志物表达上升,间质样标志物表达下降。各组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimintin及ZO-1相对表达量比较,H_(2)O_(2)组与NG组及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ZO-1免疫荧光染色实验显示,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组的细胞连接紧密程度优于H_(2)O_(2)组。结论DRP1可调控线粒体动态平衡,靶向DRP1可改善线粒体功能并抑制EMT进展,从而减轻H_(2)O_(2)诱导的RPE细胞功能障碍。

热休克转录因子1对视网膜色素上皮细胞抗氧化和抗衰老的调控作用

目的探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中HSF 1基因,构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(ARPE/Hsf1-/-),分别命名为H8、H9细胞株。取野生型、H8和H9细胞株,应用DHE探针染色结合流式分析技术测定细胞内活性氧簇(ROS)含量,应用流式细胞分析方法测定细胞周期;采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同培养时间点细胞活力值;采用结晶紫染色实验测定细胞相对存活率;采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验检测衰老细胞比率;采用Western blot法检测各细胞株中热休克蛋白(HSP)70、HSP27、聚集素(CLU)、p53、p21和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法测定各细胞株中p53、p21、IL-6、IL-8、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA表达水平。比较各细胞株在不同热休克处理条件下和HSP90抑制剂IPI504处理下热休克反应相关蛋白相对表达量,比较各细胞株不同浓度H_(2)O_(2)处理后相对存活率,比较各细胞株经或未经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后p21蛋白相对表达量。结果基因测序显示H8和H9细胞株成功携带突变基因,Western blot检测结果显示H8、H9细胞株不表达HSF1蛋白,HSF1在ARPE-19细胞中被成功敲除。与野生型细胞株相比,H8、H9细胞株中的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);各细胞株HSP90蛋白相对表达水平总体比较,差异无统计学意义(F=0.29,P>0.05)。在不同热休克刺激和IPI504诱导下野生型细胞株中HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与野生型细胞株相比,H8和H9细胞株的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著低于相应处理的野生型细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与野生型细胞株相比,H8和H9细胞株培养24、48、72和96 h的细胞活力均显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与野生型细胞株比较,H8和H9细胞株G1期细胞百分比显著升高,细胞周期抑制因子p53、p21的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),SA-β-gal染色阳性细胞比率显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.001);衰老相关炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、MCP1 mRNA相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.001)。H8和H9细胞株ROS含量明显高于野生型细胞株,差异均有统计学意义(均P<0.001);H8和H9细胞株经NAC处理后p21蛋白相对表达量较未经NAC处理明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。H8和H9细胞株200、400、600、800μmol/L H 2O 2处理条件下细胞相对存活率明显低于野生型细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论敲除HSF1可下调HSP的表达,激活ROS/P53/P21通路,诱导RPE细胞衰老,并增加RPE对氧化应激刺激的敏感性。HSF1在RPE细胞中可能具有抗衰老和抗氧化调控作用。

LncRNA HAGLR靶向miR-625-5p对脂多糖诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

目的 探讨长链非编码RNA HAGLR(LncRNA HAGLR)是否可通过靶向调控微小RNA-625-5p(miR-625-5p)表达而影响脂多糖(LPS)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡、炎症因子表达,为揭示视网膜病变机制奠定实验基础。方法 将LPS诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)设为LPS组,正常培养的ARPE-19细胞设为Con组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA HAGLR、miR-625-5p表达水平。根据转染物不同分为LPS+sh-NC组、LPS+sh-HAGLR组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-625-5p组、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC组、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;验证LncRNA HAGLR、miR-625-5p靶向关系;Western blot检测活化的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cleaved-Caspase 3)、cleaved-Caspase 9蛋白水平。结果 与Con组比较,LPS组LncRNA HAGLR表达水平升高,miR-625-5p表达水平降低(均为P<0.05),细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均升高(均为P<0.05)。与LPS+sh-NC组比较,LPS+sh-HAGLR组细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均降低(均为P<0.05);LncRNA HAGLR可负向调控miR-625-5p表达水平(P<0.05)。与LPS+miR-NC组比较,LPS+miR-625-5p组miR-625-5p表达水平升高,细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均降低(均为P<0.05)。与LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC组比较,LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p组miR-625-5p表达水平降低,细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均升高(均为P<0.05)。结论 干扰LncRNA HAGLR表达可通过靶向调控miR-625-5p表达抑制细胞凋亡、炎症因子表达,以减轻LPS诱导的ARPE-19细胞损伤。

姜黄素对人视网膜色素上皮细胞中基质金属蛋白酶、纤维粘连蛋白1表达的影响观察

目的观察姜黄素对人视网膜色素上皮(RPE)细胞中基质金属蛋白酶(MMP)、纤维粘连蛋白1(FN1)表达的影响。方法将人RPE细胞分成2组,姜黄素组加入0.5×10^(-5)mol/L的姜黄素,对照组不加姜黄素,两组细胞继续孵育48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1 mRNA,采用Western blotting法检测细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1蛋白。结果姜黄素组细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1 mRNA相对表达量分别为0.41±0.14、5.02±0.22、1.09±0.21、0.47±0.28、2.50±0.21,对照组分别为5.10±0.38、6.43±0.15、0.27±0.19、1.82±0.12、6.83±0.18,两组相比,P均<0.05。姜黄素组细胞中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、FN1蛋白相对表达量分别为6155.33±124.01、6208.00±157.33、8126.33±235.78、3541.67±130.16、3684.33±90.22,对照组分别为16207.33±210.19、8053.33±61.98、2543.67±122.20、9477.33±108.68、8218.00±239.86,两组相比,P均<0.05。结论姜黄素可上调人RPE细胞中MMP1、MMP2、MMP9、FN1的表达,下调MMP3的表达。

多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞在治疗年龄相关性黄斑变性中的挑战与前景

多能干细胞(PSC)来源的视网膜色素上皮细胞(RPE)已成为治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)潜在的治疗方法之一。然而,PSC诱导分化的RPE存在一些潜在的安全性问题,如未分化PSC或基因组和表观基因组异常等细胞致瘤的危险因素,因此成为研究者们重点关注的问题。本文将重点综述PSC来源的RPE细胞的纯化方法、体外检测未分化PSC残留的方法以及基因组和表观基因组异常对RPE细胞的影响。