视网膜色素变性中VSIG4基因变异对小胶质细胞功能的影响及其作用机制

目的研究视网膜色素变性(RP)中的V-set和免疫球蛋白结构域4(VSIG 4)基因变异对小胶质细胞功能的影响及其作用机制。方法利用免疫荧光染色检测VSIG4在小鼠视网膜中的定位。给HMC3细胞(人小胶质细胞系)转染野生型(Len-WT)、突变型(Len-Mut)VSIG 4基因以及转染空载病毒(Len-Cont),并通过有或无脂多糖(LPS)刺激HMC3细胞分为对照组、LPS-Len-WT组、LPS-Len-Mut组、LPS-Len-Cont组、Len-WT组、Len-Mut组和Len-Cont组。采用实时荧光定量PCR检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、核转录因子κB(NF-κB)p65亚单位(P65)和磷酸化P65(PP65)的蛋白表达水平;采用吞噬实验检测细胞吞噬功能;采用细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移能力。将LPS刺激状态下的HMC3细胞与661W细胞(小鼠视网膜感光细胞)共培养,采用Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平,采用凋亡实验检测661W细胞的凋亡数量。结果VSIG4定位于小鼠视网膜小胶质细胞。实时荧光定量PCR检测结果显示,与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Western blot检测结果显示,与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞Nrf2、HO-1、GPX4的蛋白表达水平均显著降低,PP65/P65比值显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。吞噬实验检测结果显示,Len-Cont组、LPS-Len-Cont组、LPS-Len-WT组和LPS-Len-Mut组细胞吞噬率分别为(35.67±3.22)%、(63.67±10.07)%、(84.00±3.46)%和(64.67±2.31)%,各组HMC3细胞吞噬率总体比较差异有统计学意义(F=59.06,P<0.001)。与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞吞噬率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕和Transwell实验检测结果显示,与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞24、48 h时迁移率和24 h时单位面积侵袭细胞数显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与LPS-Len-WT组相比,共培养系统中LPS-Len-Mut组Bax/Bcl-2蛋白表达量比值及细胞凋亡数量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论VSIG4定位于小鼠视网膜小胶质细胞。RP中的VSIG 4基因变异后,LPS刺激状态下的HMC3细胞NF-κB信号通路激活,Nrf2/HO-1信号通路活化程度减弱,细胞分泌炎症因子增多;吞噬和迁移能力减弱;共培养系统中细胞凋亡增加。

Adgrv 1基因经Hedgehog通路调控纤毛发育致视网膜色素变性的研究

目的:从Hedgehog(Hh)信号通路分析Adgrv1基因变异致Usher综合征(USH)的机制。方法:基于Adgrv1变异模型小鼠(Adgrv1^(-/-)),野生型(WT)C57BL/6小鼠为对照,从细胞水平和视网膜组织水平采用qRT-PCR、HE、视网膜透射电镜和免疫荧光方法验证Adgrv1基因变异对纤毛结构的影响,分析Hh信号通路关键因子的表达变化。结果:Adgrv1基因在视网膜和原代培养肺成纤维细胞中均有表达,但Adgrv1^(-/-)小鼠表达量显著降低。Adgrv1基因变异可造成光感受器外节盘膜溶解,以及原代肺成纤维细胞纤毛长度明显缩短,在视网膜组织和细胞水平Hh信号通路上Ptch1、Gli基因表达明显下降,而PKA基因表达上升。结论:Adgrv1基因变异致视网膜色素变性,与Hh通路中PTCH1、GLI1蛋白表达降低,使得细胞纤毛缩短,视网膜光感受器细胞外节盘膜溶解有关。

X连锁隐性遗传视网膜色素变性一家系RPGR和RP2基因的突变分析

目的对1个X连锁视网膜色素变性(XLRP)家系进行RPGR和RP2基因的突变分析。方法采集该家系11个成员(患者3例,正常人8例)的外周静脉血,提取基因组DNA。应用PCR方法扩增RPGR和RP2基因的全部外显子和内含子交界处序列,包括RPGR基因15号外显子开放阅读框,产物直接测序进行突变分析。结果在RP2发现了1个多态数据库已报道的单核苷酸多态(SNP);在RPGR基因中发现了11个SNP,其中3个为已知SNP,8个为本研究首次报道。所有序列变异与疾病表型无共分离现象。结论排除了RPGR和RP2基因突变导致该家系XLRP的可能性。

结晶样视网膜色素变性中与CYP4V2基因相关的致病突变

目的:使用Sanger测序法鉴定2个中国结晶样视网膜色素变性(BCD)家系中CYP4V2基因的突变位点。方法:收集2019-01/09临床诊断为BCD患者的临床相关资料。采集患者、患者家系成员的外周血,提取DNA,利用Sanger测序法鉴定突变位点。结果:共收集2个BCD先证者,先证者均表现为渐进性视力下降,眼底均可见典型的结晶样物质沉积。测序发现先证者1及其患病的哥哥,妹妹均在CYP4V2基因上存在c.802-8_810del17insGC的纯合突变。而先证者2则在CYP4V2基因上存在c.219T>A(p.F73L)、c.802-8_810del17insGC杂合突变。结论:中国BCD患者中最常见的c.802-8_810del17insGC突变在先证者1家系中为纯合突变,是其家系的致病突变。而先证者2则携带了中国BCD患者最常见的c.802-8_810del17insGC杂合突变,同时先证者2还携带c.219T>A(p.F73L)错义突变,突变均影响了CYP4V2基因的正常编码,进而导致疾病。

51个视网膜色素变性家系遗传学特征分析

目的分析视网膜色素变性(RP)家系的致病基因。方法采用家系调查研究方法,收集2019年6月至2022年12月就诊于武汉大学人民医院的中国51个RP家系的临床资料,包括患者病史、家族史及眼科检查临床资料,眼科检查临床资料包括最佳矫正视力、裂隙灯显微镜、彩色眼底照相、眼底自发荧光、黄斑区光学相干断层扫描、视野及视网膜电图。采集患者及家属外周血,提取DNA,进行全外显子测序,对发现的变异位点进行生物信息学分析、Sanger验证。采用SIFT、Polyphen等在线软件预测错义变异致病性,采用Mutation Taster在线软件评估错义变异位点的保守性,采用varSEAK、spliceAI对剪切变异进行预测,并用Clustalw软件对新发现的变异位点进行多物种蛋白质氨基酸序列比对。结果51个家系中,2例先证者伴有听力障碍,被诊断为Usher综合征,2例先证者眼底成像除典型RP特征外还出现黄白色结晶样物质沉着,其余家系先证者眼底成像表现为典型RP。51个家系中,29个家系在15个致病基因中检测出38个单核苷酸变异(SNVs)和3个拷贝数变异,包括PRPF 6、PRPF 31、RHO、CYP 4V2、USH 2 A、EYS、MERTK、PCDH 15、ABCA 4、BBS 2、PROM 1、SPATA 7、RPE 65、RPGR、OFD 1基因,38个SNVs中有6个未曾报道过的新变异,分别是USH 2 A基因c.12523T>C(p.Trp4175Arg)、c.1723T>C(p.Cys575Arg)、c.1875C>G(p.Phe625Leu),CYP 4 V 2基因c.1441C>T(p.Leu481Phe),MERTK基因c.2487-8A>G和PCDH 15基因c.5183del(p.Arg1728LysfsTer116)。SIFT、Polyphen预测软件对USH 2 A基因p.Trp4175Arg、p.Cys575Arg、p.Phe625Leu和CYP 4 V 2基因p.Leu 481Phe这4个错义变异位点造成的氨基酸改变预测均为致病或有害,保守性分析显示其在多个物种中保守。spliceAI、varSEAK预测软件均提示,MERTK基因c.2487-8A>G可能会导致剪切异常,影响蛋白质功能。PCDH 15基因c.5183del(p.Arg1728LysfsTer116)为移码变异,会改变下游氨基酸序列并使翻译提前终止。CYP 4V2、USH2 A、RPGR基因为RP患者中变异频率较高的基因,占所有检出致病基因家系的50%以上,其中CYP 4V2基因致病的先证者起病较晚,但视功能下降和视网膜退变更严重。结论本研究发现了6个未报道过的变异可能是RP的致病变异;CYP 4V2、USH 2 A和RPGR基因是中国RP患者主要的致病基因;CYP 4V2基因致病的患者起病较晚,但疾病进展较快。

常染色体显性视网膜色素变性NRL基因的突变研究

目的 对中国人常染色体显性视网膜色素变性 (RP)NRL基因的突变现状进行研究。方法 抽取 12 0例RP先证者的静脉血提取DNA ,行NRL基因的引物设计合成 ,PCR扩增 ,琼脂糖电泳鉴定 ,异源双连 SSCP电泳。结果 12 0例散发型RP患者未发现NRL基因突变。

一个中国视网膜色素变性家系的RP3基因突变

目的探讨一个中国视网膜色素变性(RP)家系的突变基因位点。方法在获得知情同意后对该家系成员进行病史采集、眼部检查和病情追溯,绘制家系图,并对其中26例采血,进行DNA提取、聚合酶链反应、RP3基因外显子ORF15测序。结果该家系共有成员57名,其中直系42名(含21例患者)。患者表现为夜盲、近视、眼底色素沉着、血管细、视盘淡,视野向心性缩窄甚至呈管状,暗视视网膜电图(ERG)显示a波、b波振幅明显下降甚至记录不到。家系特点为男性患者的女儿全部患病、男性患者的母亲均是患者,符合X连锁显性遗传特征。经PCR反向测序,发现突变位点位于ORF15+1339delA。结论该家系患者病变由RP3基因外显子ORF15+1339delA位点突变所致。

视网膜色素变性一家系与IMPDH1基因突变相关

目的检测一个常染色体显性遗传性视网膜色素变性家系的IMPDH1基因的突变特征以及与临床表型的关系,探讨其病因和发病机制,利用分子遗传学的方法,确定家系内遗传连锁关系。方法严格按照有关伦理学要求进行家系收集,所有现存家系成员行详细的眼科检查(包括视力检查、裂隙灯和眼底镜检查、视野、暗适应阈值以及ERG检查)。提取该家系10例患者、10例未患病成员外周血基因组DNA;应用聚合酶链反应扩增IMPDH1第7外显子基因片段,利用扩增产物直接测序方法对样本进行IMPDH1基因突变检测。结果该家系中10例患者的IMPDH1基因发生了Asp-226-Asn(GAC→AAC)的错义突变,10例家系未患病成员则没有此突变。结论IMPDH1基因的一种已知突变Asp-226-Asn与该家系所发生的视网膜色素变性存在紧密连锁关系。

眼病候选基因芯片在一汉族视网膜色素变性家系分子遗传学中的应用

背景 视网膜色素变性（RP）是一种累及视网膜光感受器细胞及色素上皮细胞的遗传性致盲眼病.RP的发病机制及临床特征较复杂,具有遗传异质性和临床异质性.随着基因组学的迅猛发展,越来越多的研究手段应用于RP致病基因筛查.目的 通过眼科基因芯片测序方法探讨一常染色体遗传RP家系临床表型及其基因突变情况.方法 于2013年6月在重庆市荣昌县收集一汉族RP家系,对该家系所有患者进行眼科检查确诊后,抽取12名家系成员外周静脉血各1 ml,应用华大基因眼科芯片目标区域捕获技术进行基因突变检测.该基因芯片覆盖了眼病相关的基因编码区（包括59个RP候选基因）,选择家系内2例RP患者（Ⅱ5、Ⅱ7）的DNA样本进行目标区域捕获测序.通过生物信息学技术对测序结果进行分析,对共有的变异位点进行Sanger测序验证.结果 该家系为常染色体遗传的RP家系.通过基因芯片分析发现该家系Ⅱ5和Ⅱ7患者存在2个共有基因突变：USH2A （c.3065T＞C,p.Phe1022Ser）突变和PDE6A（c.1699G＞A,p.Ala1319Gly）突变,家系其他成员检测结果表明2个基因突变未与疾病共分离.该眼科基因芯片高通量测序技术虽然未定位该家系致病基因,但快速排除了RP常见候选基因,为进一步分析奠定了研究基础.结论 采用基于目标区域捕获测序的眼科基因芯片技术可以快速、准确地筛查RP常见候选基因,是眼科疾病遗传研究的一项适用且高效的新方法.

视网膜色素变性遗传致病基因peripherin/RDS的突变筛选

目的 了解中国视网膜色素变性患者 (RP)中peripherin/RDS基因的突变谱及突变率。方法 应用聚合酶链-异源双链 -单链构象多态性 (PCR SSCP)及DNA序列分析技术对收集的 15个常染色体显性遗传视网膜色素变性家系和 5 5例散发视网膜色素变性患者peripherin/RDS基因的第一、第二外显子进行检测。结果 15个家系及 5 5例散发患者未检测到peripherin/RDS基因突变。结论 本研究所检测的视网膜色素变性患者与RDS基因无关。显示视网膜色素变性的遗传异质性。

视网膜色素变性的遗传异质性及分子机制研究进展

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一组最常见的严重的遗传性致盲性视网膜变性疾病[1],主要表现为光感受器细胞变性,在疾病早期以视杆细胞变性为主,随着疾病的进展逐渐累及视锥细胞。在全世界人口中,RP的基因突变发生率为0.025%~0.04%,约有250万人受累[1]。临床上以夜盲、进行性视野缩小为主要表现,眼底检查可见视盘蜡黄、视网膜血管变细、视网膜骨细胞样色素沉着三联征,视网膜电图(ERG)在发病早期即可表现为振幅降低。

IMPDH1基因突变与视网膜色素变性的研究进展

视网膜色素变性(RP)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致的最常见的遗传性致盲眼底病,具有高度的遗传异质性及临床异质性。IMPDH1存在于全身各处器官中。近年来对RP发病机制的探讨已成为研究热点。随着对IMPDH1基因研究的深入,人们发现IMPDH1基因对RP的发病机制研究有着重要意义。对于这种致病基因的结构、突变及其功能目前已有了新的研究进展。本文综述了IMPDH1基因在视网膜色素变性中的最新研究进展。

常染色体显性视网膜色素变性家系的基因连锁定位和候选基因的序列分析

目的对一常染色体显性视网膜色素变性(RP)家系进行致病基因的连锁定位,并对候选基因进行序列分析。方法在家系中进行全基因组扫描以确定与疾病连锁的染色体区域,对该区域附近的候选基因进行直接序列分析。结果此家系致病基因的最小可能区域(MCR)被定位于19号染色体微卫星标记D19S246和D19S601之间不到5厘摩(cM)的区域。对该区域附近的候选基因进行直接序列分析的结果并未发现致病性基因突变。结论CRX(锥杆细胞同源基因)和PRPF31基因是该家系的非致病性基因,在19号染色体上可能存在导致常染色体显性视网膜色素变性(adRP)的新的致病基因。

视网膜色素变性和视锥-视杆细胞营养不良患者基因突变频谱分析

目的:分析中国宁夏地区常染色体隐性遗传视网膜色素变性(ARRP)及视锥-视杆细胞营养不良(CORD)的基因突变频谱。方法:纳入2016-09/2020-02在宁夏人民医院眼科医院就诊的35例ARRP患者和18例常染色体隐性CORD患者,行详细的眼科检查。抽取外周静脉血,对先证者应用包含232个致病基因的遗传性视网膜疾病捕获芯片进行靶向捕获富集高通量测序。利用在线分析软件对可疑基因变异致病性进行预测,利用Sanger测序对家系成员进行共分离分析。结果:ARRP患者35例中,检测到致病基因16个,以RP1基因突变率最高,占14%(5/35),其次为ABCA4、CRB1和EYS基因,均占11%(4/35);18例常染色体隐性CORD患者中,检测到致病基因10个,以ABCA4基因突变率最高,占28%(5/18),其次为ALMS1、PROM1、RPE65、USH2A基因,均占11%(2/18);ARRP和CORD患者中,共同致病基因有ABCA4、CLN3、CRB1、PROM1、NRL共5个,占42%(22/53)。结论:ARRP及CORD两种疾病在表型之间具有一定程度的相似性和交叉性,致病基因突变谱上存在一定重叠性。宁夏地区最常见的重叠基因为ABCA4。

两个中国视网膜色素变性家系EYS新突变位点的临床表型分析

目的 应用目标区域捕获技术检测两个中国视网膜色素变性(RP)家系的EYS新突变位点,并分析其类型与临床表型特征的关系。方法 采集2018年10月在沈阳何氏眼科医院门诊确诊为视网膜色素变性的两个家系共6人纳入研究,采集所有受检者外周血5 ml,提取DNA后,采用目标区域捕获测序和Sanger验证来鉴定基因变异位点,并进一步分析该基因变异的特殊临床表型。结果 在两个家系中,门诊确诊2例患者, 4例正常表型家庭成员。基因检测发现, 1例视网膜色素变性家族中发现了EYS基因的两个错义杂合突变c.3489T>A和c.5852C>T。在另一例视网膜色素变性家族中发现了EYS基因的两个基因突变,分别是c.6557G>A和c.8153C>A,经家系共分离确认为复合杂合突变。两个家系的夜盲发病年龄提前,视力极差。结论 本研究报告了2例中国常染色体隐性遗传视网膜色素变性(ARRP)家系中EYS的两个新发突变位点c.8153C>A和c.5852C>T,扩充了视网膜色素变性的基因谱和新的临床表型。光学相干断层扫描血管成像(OCT-A)检查有助于评估黄斑中心凹下脉络膜毛细血管萎缩程度,间接评估病情发展。

视网膜色素变性缓慢型视网膜变性基因突变的研究

视网膜色素变性（ＲＰ）是由视网膜光感受器和色素上皮细胞变性导致的，特征为夜盲和进行性视野缺损的一组常见致盲眼底病，同时又是具有遗传异质性的单基因遗传病，是遗传性视觉损害和致盲的最常见原因之一。目前全世界约有１５０万人患此病，其中中国人占１／４左右。由...

视网膜色素变性中GUCA1B、GNGT1和RGS9基因突变筛查

为寻找视网膜色素变性的致病基因 ,从 12 0个家系收集视网膜色素变性先证者 ,制备基因组DNA。应用PCR%D异源双链 -SSCP法 ,分析GUCA1B基因 4个外显子、GNGT1基因编码区和RGS9基因视网膜特异性转录区 ,寻找基因变异。序列分析确定突变。结果表明 ,31人的GUCA1B基因外显子 1存在T/C多态。所有先证者中均未检测到GUCA1B、GNGT1和RGS9基因突变。认为本组病例未发现GUCA1B、GNGT1和RGS9基因的突变。

视紫红质基因在显性视网膜色素变性家系的突变筛查

目的:探讨视紫红质基因在视网膜色素变性疾病中的作用。方法:通过聚合酶链反应(PCR)对4个显性视网膜色素变性家系先证者视紫红质基因的5个外显子进行扩增,扩增产物进行直接测序。结果:视紫红质基因全部编码序列在4个家系先证者中均未发现碱基改变,TJE14及TJE15先证者第1外显子上游非编码区中第70个碱基出现A/G套峰,在TJE15先证者第5外显子第1185碱基出现A/C套峰;而在TJE16先证者中第1外显子上游非编码区中第45个碱基为纯合子GG,第70个碱基为纯合子AA;TJE17先证者第1外显子上游非编码区中第45个碱基为纯合子AA,第70个碱基为纯合子GG。结论:视紫红质基因在中国人群中突变率不如欧美人高,它可能不是导致中国人显性视网膜色素变性的主要致病基因。

常染色体显性遗传视网膜色素变性家系视紫红质基因突变分析

目的:观察常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomaldominantRP,ADRP)家系视紫红质基因(rhodopsin,RHO)的突变特征。方法:抽取11个ADRP家系成员的外周血3～5mL,提取DNA;应用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增RHO基因的第1至5外显子基因片断,对PCR产物进行直接测序。结果:在1个家系中有3例ADRP患者297密码子存在杂合的2种类型的密码子(AGC和AGT)。另外,该家系在第3外显子3'端下游第4个碱基处发生C-T转换,呈T纯合子的1例,8例呈杂合子状态。结论:Ser-297-Ser系基因多态现象。另外,RHO基因第3外显子3'端下游内含子处发生的C/T多态性是否与RP的发生存在相关性,需进一步研究。

白点状眼底与视网膜色素变性共存家系的RDH5基因诊断

目的:在母亲诊断为白点状眼底(fundus albipunctatus,FA)而3个子女均为视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)的家系中进行RDH5基因的分子遗传学检查,确定一种新型变异。方法:对家系成员进行系统的眼科检查,同时采用聚合酶链反应(PCR)和DNA直接测序法对RDH5基因的编码区进行基因组测序和突变筛查,并在100名正常对照者中对RDH5基因突变的检测结果进行验证。结果:先证者的母亲确诊为FA,而3个子女诊断为RP。母亲、哥哥和姐姐的RDH5基因检测出c.689_690CT>GG突变,而先证者及其母亲存在已报道的c.928delCinsGAAG变异。结论:本家系中母亲的FA来源于复杂的异质突变,其中c.689_690CT>GG突变是包括欧美各国在内没有报道过的新变异,而3个子女患RP的分子遗传学病因还有待进一步的研究。