LIM同源框基因家族与神经系统

同源框基因是指一类含有同源序列的基因，它编码的蛋白质作为转录调节因子调节细胞的发育和分化，控制基因的表达形式。ＬＩＭ同源框基因不仅含有同源框基因也含有编码ＬＩＭ结构域的保守序列。现已发现的属该家族的基因ｌｉｎ－１１、ｍｅｃ－３、ａｐｔｅｒｏｕｓ（ａｐ）、ｉｓｌ－１、ＬＨ－２、Ｒｌｉｍ、ｌｉｍ－１、ｌｍｘ－１、Ｘｌｉｍ－１和Ｘｌｉｍ－３基因等，并且还将会有新的发现。迄今的研究结果表明，ＬＩＭ同源框基因家族的表达产物主要在生物的分化和发育中起调节作用。

Rx同源异型盒基因与视觉神经系统发育的关系

Ｒｘ（ｒｅｔｉｎａｌｈｏｍｅｏｂｏｘ）家族是新发现的一类与视觉神经系统发育密切相关的同源异型盒基因，调控眼基质、视泡、视网膜、前脑以及中脑部分区域的发育．

配对相关同源框1蛋白、癌易感性候选基因2在原发性肝癌组织中的表达及临床意义

目的:分析配对相关同源框1蛋白(paired related homoeobox-1,PRRX1)、癌易感性候选基因2(cancer susceptibility candidate-2,CASC2)在原发性肝癌组织的表达特点,探讨其与临床病理参数和预后的关系。方法:收集2014年1月至2017年1月收治的72例经手术切除的原发性肝癌患者癌组织、癌旁组织石蜡标本。采用实时荧光定量聚合链反应(real-time fluorescence quantitative polymerization chain reaction,qRT-PCR)检测PRRX1、CASC2表达。分析PRRX1、CASC2表达与临床病理参数的关系。以随访期间患者死亡为终点事件,分析PRRX1、CASC2表达与患者预后的关系。结果:原发性肝癌组织中PRRX1、CASC2表达均低于癌旁组织(P<0.05)。PRRX1表达与血管侵犯、肝内转移、远端转移和TNM分期有关系(P<0.05);CASC2表达与肿瘤分化程度、TNM分期有关系(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,PRRX1低表达组、CASC2低表达组原发性肝癌患者3年生存率均低于PRRX1高表达组、CASC2高表达组患者(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,远端转移、PRRX1低表达、CASC2低表达与原发性肝癌患者不良预后独立相关(P<0.01)。结论:PRRX1、CASC2在原发性肝癌组织中呈低表达。PRRX1、CASC2低表达可能与原发性肝癌发生和进展有关,可作为其预后评估的辅助指标。

丙泊酚调控长链非编码RNA同源框基因反义RNA2对肾癌细胞生物学行为的影响

目的探讨丙泊酚对肾癌细胞生物学行为的影响及其潜在机制。方法以正常培养的人肾癌786-O细胞为对照组,用含2、5、10 mg/L丙泊酚的RPMI 1640培养液孵育的786-O细胞为2、5、10 mg/L丙泊酚组。应用细胞计数试剂盒法检测4组细胞活力,应用平板克隆实验检测4组细胞克隆形成能力,应用流式细胞仪检测4组细胞凋亡情况,应用Transwell实验检测4组细胞迁移和侵袭情况,应用实时定量聚合酶链反应法检测4组细胞同源框基因反义RNA2(HOXA-AS2)的表达,应用蛋白质印迹法检测B细胞淋巴瘤2家族蛋白(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)的表达情况。786-O细胞分别转染si-HOXA-AS2、si-NC、pc DNA-HOXA-AS2(si-HOXA-AS2组、si-NC组、pc DNA-HOXA-AS2组),用含10 mg/L丙泊酚的RPMI 1640培养液孵育转染pc DNA-HOXA-AS2细胞(丙泊酚+pc DNA-HOXA-AS2组),分别采用上述方法检测786-O细胞的活力、克隆形成、凋亡、迁移和侵袭能力。结果 2、5、10 mg/L丙泊酚组786-O细胞的吸光度值、克隆形成数、Bcl-2蛋白、HOXA-AS2的表达水平均显著低于对照组,细胞迁移数、侵袭数均显著少于对照组,凋亡率、Bax蛋白表达均显著多于对照组(均P <0.05)。随着丙泊酚浓度的增加,其对786-O细胞的吸光度值、克隆形成数、Bcl-2蛋白、HOXA-AS2表达以及细胞迁移和侵袭的抑制作用逐渐增强,对细胞凋亡、Bax蛋白表达的促进作用逐渐增强(均P <0.05)。si-HOXA-AS2组786-O细胞的吸光度值、克隆形成数、迁移数、侵袭数、Bcl-2蛋白和HOXA-AS2表达量均显著低于si-NC组,凋亡率、Bax蛋白表达量均显著高于si-NC组(均P <0.05)。丙泊酚+pc DNA-HOXA-AS2组786-O细胞HOXA-AS2的表达、吸光度值、克隆形成数、Bcl-2蛋白表达显著高于10 mg/L丙泊酚组[(0.840±0.079)比(0.153±0.017)、(0.77±0.04)比(0.33±0.03)、(98.0±2.4)比(40.7±2.0)、(0.623±0.037)比(0.173±0.012)],细胞迁移数、侵袭数显著多于10 mg/L丙泊酚组[(145.7±7.6)个比(77.0±2.8)个、(116.3±3.7)个比(47.7±2.5)个],凋亡率、Bax蛋白表达显著低于10 mg/L丙泊酚组[(11.25±0.69)%比(24.79±0.99)%、(0.300±0.029)比(0.820±0.071)](均P <0.05)。结论丙泊酚通过下调lncRNA HOXA-AS2的表达抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。

同源框基因IsL-1在中枢神经系统中的表达

同源框基因ＩｓＬ－１在中枢神经系统中的表达丁晓虹＊李统威范明（军事医学科学院基础医学研究所＊北京市卫生学校）在以往工作中用免疫组化和原位杂交的方法证明在成年大鼠中枢神经系统有同源框基因ＩｓＬ－１的广泛表达。但阳性细胞集中于小脑、海马和脊髓等处，大脑皮...

普通菜豆中烟草水杨酸结合蛋白2同源基因的鉴定及表达特征分析

水杨酸(salicylic acid,SA)能够诱导植物产生系统抗病性反应,而水杨酸结合蛋白2(salicylic acid binding protein 2,SABP2)是植物细胞内调控水杨酸水平的重要酯酶。本研究利用生物信息学方法在普通菜豆中搜索到7个烟草水杨酸结合蛋白2的同源基因,命名为PvMES1~PvMES7。分别在2个菜豆感病品种(白刀豆和BRB130)和2个抗病品种(黑芸豆和260205)中接种尖镰孢菌FOP-DM01菌株(Fusarium oxysporum f.sp.phaseoli isolate,FOP-DM01)后,检测寄主根组织中水解水杨酰甲酯(methyl salicylate,Me SA)活性和游离SA含量的变化,并利用荧光定量PCR技术分析7个PvMES基因表达量变化。结果表明,PvMES1、PvMES3、PvMES4、PvMES5和PvMES6的转录表达受FOP-DM01菌株诱导均呈现不同程度的升高,其中黑芸豆中PvMES5基因和260205中PvMES1基因表达量变化最显著,接种3 d后分别升高至0 d表达量的7.6倍和5.6倍。此外,黑芸豆和260205根中水杨酰甲酯酯酶(methyl salicylate esterase,MES)活性显著提升,游离SA含量也相应升高,激活寄主内SA介导的相关防御反应。本研究结果可以为普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病分子育种和抗病机理研究提供理论基础。

猪瘟病毒分离株E_2基因的克隆与酵母表达系统转移载体的构建

用猪肾细胞 (PK- 15 )繁殖猪瘟病毒 (CSFV)分离株 HL - L Y,根据基因库已发表的 CSFV E2 基因序列 ,设计并合成一对引物 ,以 CSFV总 RNA为模板 ,通过 RT- PCR技术扩增出约 1.1kb的片段 ,即 E2 基因。将 RT- PCR产物先克隆到 p MD18- T载体上 ,构建了重组质粒 T- E2 ,再通过双酶切亚克隆到表达载体 p PIC9的多克隆位点 (MCS)上 ,经酶切、PCR鉴定和测序分析 ,表明均已成功获得了 CSFV E2 基因的重组体 p PIC9- E2 。将该测序结果与国内几个毒株 SHIMEN,C,C- V- L Z,GS- L T,GS- L X分别进行序列同源性比较 ,核苷酸同源性分别为 96 .5 1% ,95 .5 3% ,89.12 % ,78.6 6 % ,77.2 3% ;氨基酸同源性分别为 97.32 % ,95 .71% ,89.5 4 % ,83.16 % ,83.4 2 %。表明该毒株与国内标准毒株 SHIMEN株和

Vax基因与视觉神经系统的早期发育

视觉神经系统的发育与形成是一个相当复杂的过程 ,其基因调控机理是神经发育生物学领域的研究热点 .Vax基因家族是新近发现的一类与视觉神经系统发育密切相关的同源异型盒基因 ,调控前脑、眼原基、视泡、视柄以及视网膜的发育 .Vax 1参与色素上皮和视柄的分化 ;Vax 2则在视网膜及视神经背腹轴建立方面起重要作用 .Vax基因的研究将对阐明视觉神经系统发育调控机制提供新的认识 .

Nkx2-5基因诱导P19细胞分化中心肌标志物的表达

目的研究同源框基因Nkx2-5在心肌发生中的作用。方法实验分转染组和未转染组,转染组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,未转染组细胞为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4、8、12、16d,免疫细胞化学检测α横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)基因的表达。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁的8、12、16d出现表达,表达量有增高趋势;16d与8d比有显著差异(P<0.01);RT-PCR结果显示:转染组GATA-4在贴壁培养的4d有表达,8、12d表达逐渐增多,16d时表达有所下降。α-MHC和ANF在贴壁培养的8d有表达,12d和16d时表达逐渐增多。统计结果表明GATA-4在8、12、16d的表达量与4d比有显著差异(P<0.05或P<0.01),α-MHC在12、16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.05,P<0.01),ANF在16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.01),16d表达量与12d比也有显著差异(P<0.01);未转染组结果均为阴性。结论外源表达Nkx2-5基因可诱导P19细胞逐渐表达心肌标志物。

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。

利用CRISPR/Cas9技术对VSX 2绿色荧光报告基因人诱导多能干细胞系的构建

目的构建表达视觉系统同源框2(VSX 2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理,设计VSX 2的小向导RNA(sgRNA),构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒;2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系,采用嘌呤霉素筛选获得单克隆,扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型;采用核型分析法分析报告细胞系核型;采用STR法排除细胞交叉污染;采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达;通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力;应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官,并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX 2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明,BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明,BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性,包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明,由BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性;eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。结论成功构建1株表达VSX 2-eGFP报告基因的hiPSCs,该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化,为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

云南省西南边境登革2型病毒全基因组序列特征研究

为阐明云南省西南边境地区登革2型病毒(DENV-2)流行株的全基因组序列特征及流行病学特点,采用C6/36细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-2的全基因组序列,采用Clastal X1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸同源性及系统进化分析。结果从登革热患者血清中分离到10株DENV-2,其中德宏州瑞丽市6株(2013年3株和2015年3株),西双版纳州景洪市2015年4株。经RTPCR和序列测定,获得这10株DENV-2的全基因组序列。基于结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化和同源性分析表明,这10株病毒中5株为亚洲基因Ⅰ型(AsianⅠGenotype,AG-Ⅰ),5株为全球基因型(Cosmopolitan genotype,CG)。其中2013和2015年瑞丽流行株均为AG-Ⅰ,景洪市2015年流行株均属CG,它们均与东南亚相同基因型流行株具有较高的同源性和较近的亲缘关系。云南株与DENV-2原型株(New Guinea-C)的E和NS5基因核苷酸同源性分别为93.38%~93.77%和92.80%~94.74%。所有云南株和东南亚参考株与New Guinea-C株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点均存在一定程度的改变。本研究证实,云南省西南边境地区存在DENV-2两种基因型流行,瑞丽和景洪流行株分别为AG-Ⅰ和CG,但它们的输入来源均为相邻东南亚国家。云南株与DENV-2原型株New Guinea-C株间存在明显差异,但决定病毒抗原、致病性和毒力的关键位点未发现明显变化。

SEN病毒部分基因系统进化分析

目的:通过序列比对分析SEN病毒(SENV)不同开放阅读框(ORF)基因系统进化情况。方法:用聚合酶链反应(PCR)方法扩增武汉地区SENVORF1和ORF2基因,结合GenBank中SEN病毒基因信息对该基因进行序列测定、并采用clutal软件系统进行分析。结果:武汉SEN病毒株与北京株同源性较高,与日本株有一定的差异,和TT病毒有较大差异。结论:SENV可能不是TTV亲缘关系较远的变异株,而是一群不完全相同成员组成的病毒种。

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%.与其它PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间.

EZH2在泌尿系统肿瘤中的研究进展

Polycomb group(Pc G)蛋白是一组参与基因转录调控且进化极为保守的转录抑制子,其表达异常与肿瘤的发生、发展有着密切的关系,而果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)是其核心成分。近期有研究表明,EZH2在多种肿瘤组织中高表达,并与肿瘤的浸润、转移和预后密切相关。EZH2的高表达使其在基因靶向治疗研究中受到越来越多的关注,可能为泌尿系统肿瘤的治疗提供新的分子靶点。

胃癌组织幽门螺杆菌vacA基因型的分布及其与CDX2表达的关系

目的筛查辽宁地区胃癌患者幽门螺杆菌(Helicobacte pylori,H.pylori)vacA优势基因型并了解其对CDX2表达的影响,为胃癌的发生机制及因型施治提供实验室依据。方法采用GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT试剂盒提取173例H.pylori阳性石蜡包埋胃癌组织的DNA;采用PCR检测H.pylori不同vacA基因型分布情况,采用免疫组化方法检测胃癌组织CDX2蛋白表达。结果在胃癌中vacAs1,vacAm1,vacAs1m1亚型分布高于其他亚型(P<0.05),其中vacAm1,vacAs1m1与肿瘤分化程度密切相关,二者在高分化组的分布低于中低分化组(P<0.05),vacAm1在男性患者中分布高于女性(P<0.05);年龄大于60岁、高分化和肠型胃癌与CDX2的表达呈正相关(P<0.01);CDX2的低表达与vacAm1,vacAs1,vacAs1m1基因型密切相关(P<0.05)。结论vacAm1,vacAs1与vacAs1m1是辽宁地区胃癌发生的优势基因型,vacAs1m1阳性的H.pylori患者及男性vacAm1 H.pylori阳性感染者可能抑制CDX2的表达进而促进胃癌的恶性分化。

系统性红斑狼疮患者CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞中转录因子Bach2的表达及其影响

目的·研究系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞中转录因子BTB与CNC同源基因2(BTB and CNC homology 2,Bach2)的表达及其对细胞功能的影响。方法·采用流式细胞仪分选获得活动期SLE患者(SLE组)和健康对照者(对照组)外周血CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞,荧光定量PCR和Western blotting检测该类细胞中Bach2的表达;分析SLE患者该类细胞中Bach2的平均荧光强度(median fluorescence intensity,MFI)与SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)的相关性。采用流式细胞术比较SLE患者IL-17+CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞和IL-17-CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞中Bach2的MFI。在Bach2过表达体系中,采用流式细胞术检测CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞表达IL-17的细胞比例,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中IL-17的含量。结果·与对照组相比,SLE组CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞Bach2的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(均P<0.01);SLE组Bach2的MFI与SLEDAI呈显著负相关(R2=0.433,P=0.001)。SLE患者IL-17+CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞Bach2的MFI显著低于IL-17-CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞(P=0.013)。当Bach2过表达时,SLE患者CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞表达炎症因子IL-17的细胞比例明显下降(P=0.032),细胞培养上清液中IL-17含量显著降低(P=0.008)。结论·SLE患者CD4^+CD25^+CD45RA^-T细胞Bach2表达下降,在该类细胞中过表达Bach2可使IL-17表达下降。

肉鸡MTHFD2基因的克隆和表达分析

对肉鸡亚甲基四氢叶酸脱氢酶2基因(Methylene tetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2)进行克隆和生物信息学分析。结果表明:肉鸡MTHFD2基因c DNA部分片段长度为1 554 bp,编码337个氨基酸。氨基酸序列比较发现,肉鸡与日本鹌鹑的氨基酸序列一致性最高,达到97. 33%。MTHFD2蛋白跨膜结构域分析发现该蛋白位于胞外,不具备跨膜结构。MTHFD2蛋白质二级结构预测结果为:α-螺旋占31. 16%,延伸链占22. 26%,β-转角占9. 2%,无规则卷曲占37. 39%。定量PCR结果表明:MTHFD2基因在腿肌中的表达水平最高,在肝脏中的表达水平最低。研究结果将为进一步研究MTHFD2基因的结构和功能以及家禽叶酸代谢通路提供参考。