2,2',4,4'-四溴联苯醚对视黄醛受体和雌激素受体的影响

目的:探讨2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)对视黄醛受体(RXRα)和雌激素受体(ERα,ERβ)的影响,为阐明多溴联苯醚化合物神经内分泌干扰效应提供科学依据。方法:采用CCK-8法测定BDE-47对慢病毒转染技术构建的稳定高表达和低表达RXRα的MCF-7细胞系及正常细胞系的细胞毒性;并以BDE-47分别处理3种细胞,采用TBA法、XOD法及RT-PCR法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量及人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(hOGG1)mRNA表达量,采用RT-PCR和Western blot分析其对3种细胞系RXRα、ERα和ERβ的mRNα及蛋白表达的影响。结果:BDE-47对MCF-7细胞系具有明显的细胞毒性作用,作用24 h时,对RXRα正常表达、高表达和低表达的MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC_(50)分别为23.15、82.78、30.16μmol/L;BDE-47可造成3种细胞的氧化损伤,RXRα受体高表达细胞对BDE-47的细胞毒性耐受性明显高于另外两种细胞,可一定程度提高细胞抗氧化损伤能力。BDE-47对3种细胞RXRα的表达有明显的抑制作用,可诱导RXRα正常表达与低表达细胞中ERα受体的表达增强、ERβ受体的表达降低;而在RXRα高表达细胞中ERα受体的表达降低、ERβ受体的表达增强,两种雌激素受体表达变化相反。结论:BDE-47可能抑制RXRα受体表达,继而干扰ERα、ERβ两种受体的表达和二者间的平衡,从而发挥其神经内分泌毒性效应。

2,2',4,4'-四溴联苯醚通过核受体介导神经毒性作用机制的初步研究

目的:探讨2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖及对RXRα、TRs、PPARs核受体表达水平的影响,为阐明多溴联苯醚化合物神经毒性作用提供科学依据。方法:采用CCK-8法检测不同浓度BDE-47处理不同时间后的SK-N-SH细胞增殖情况;再以5、10和20μmol/L BDE-47染毒细胞24 h后,分别采用DCFH-DA荧光法、WST-1法、比色法、qPCR法测定胞内ROS水平、SOD活力、GSH-Px活力及hOGG1 m RNA表达量;采用qPCR及Western blot检测BDE-47对RXRa、TRs、PPARs受体m RNA及蛋白表达水平的影响。结果:BDE-47抑制SK-N-SH细胞增殖,其抑制作用呈明显的时间和剂量效应关系(P<0.05),24 h半数抑制浓度(IC_(50))为75.94μmol/L;与溶剂对照组相比,10和20μmol/L BDE-47导致细胞内ROS水平上升、SOD活力下降、GSH-Px活力下降、hOGG1 m RNA水平上升,并可致SK-N-SH细胞氧化损伤(P<0.05或P<0.01);BDE-47可诱导RXRα、TRs及PPARs受体各亚型m RNA及蛋白表达显著上升(P<0.05或P<0.01),并且对各亚型的诱导程度不一。结论:BDE-47抑制人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖,导致氧化损伤,上调RXRα、TRs、PPARs核受体的表达从而介导神经毒性作用。

细胞核受体RXRα在2,2′,4,4′-四溴二苯醚神经毒性中的作用及其机制

目的:探讨视黄醛X受体(RXRs)为核心的多个核受体在2,2′,4,4′-四溴二苯醚(BDE-47)致神经细胞毒性中的相互作用,揭示受体介导的多溴二苯醚(PBDEs)神经毒性效应的分子机制。方法:构建人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH的RXRα基因敲除细胞株及高表达细胞株(分别命名为RXR/KO-SK-N-SH和RXR/OE-SK-N-SH细胞);CCK-8法分别检测SK-N-SH(野生型)、RXR/KO-SKN-SH和RXR/OE-SK-N-SH细胞在BDE-47浓度分别为1、5、10、20、50、100、150、200μmol/L处理12、24、48、72 h时的细胞增殖率;qPCR和Western blot法分别检测上述3种细胞中RXRα、TRα、TRβ、PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白表达水平。结果:在染毒时间分别为12、24、48、72 h时,不同浓度BDE-47作用下3种细胞的增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。BDE-47对RXR/KO-SK-N-SH细胞的IC50是野生型和RXR/OE-SK-N-SH细胞的1/2。BDE-47处理3种细胞后,RXRα的mRNA和蛋白表达水平在野生型和RXR/OE-SK-N-SH细胞中显著升高,SK-N-SH细胞和RXR/OE-SK-N-SH细胞中TRα和PPARα的表达升高,此两种受体在RXR/KO-SK-N-SH细胞中表达降低。在本实验所采用的BDE-47处理浓度下,TRβ和PPARγ表达在3种细胞中均无明显变化。结论:RXRα在提高SK-N-SH细胞生存能力中发挥重要作用。RXRα可以介导TRα和PPARα的表达,而BDE-47并未激活或者抑制SK-N-SH细胞TRβ和PPARγ的表达。说明BDE-47对于SK-N-SH细胞的毒性主要是通过激活RXRα,进一步诱导TRα和PPARα的表达而介导的。

黄连素对HepG2细胞CYP3A4和P-gp的影响和作用机制研究

目的：阐明黄连素即盐酸小檗碱（berberine hydrochloride,BBR）对人肝癌细胞HepG2中细胞色素P450 3A4（CYP3A4）、多药耐药基因（MDR1）在mRNA和蛋白水平表达的影响,初步探讨黄连素对CYP3A4和P-糖蛋白（P-gp）的影响及其作用机制。方法：采用MTT法检测不同浓度的BBR（1～100μg/mL）对HepG2细胞活力的影响;并在BBR对HepG2细胞毒性较小的浓度范围进行实验,实验分为空白对照组、不同浓度BBR组、诱导剂利福平（Rif）组以及不同浓度BBR和Rif共同给药组,与对数期HepG2细胞孵育48h后,提取细胞RNA和总蛋白,分别采用荧光定量PCR法（QRT-PCR）、Western blot法检测HepG2细胞中CYP3A4、MDR1、孕烷X受体（pregnane X receptor,PXR）、视黄醛X受体（retinoid X receptor,RXR）在mRNA水平的表达和CYP3A4、P-gp在蛋白水平的表达。结果：BBR在1～40μg/mL浓度范围内对HepG2细胞毒性小,细胞活力大于80%,超过40μg/mL时对细胞毒性大,细胞存活率低。Western blot结果表明,与空白对照组比较,0.1、0.5和2μg/mL BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白的表达有诱导作用（P〈0.05）,但10、40μg/mL BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白的表达有显著性抑制作用（P〈0.01）。QRT-PCR结果表明,与空白对照组比较,10、20和40μg/mL BBR均对HepG2细胞PXR、CYP3A4、MDR1mRNA的表达有显著抑制作用（P〈0.05）;但10μg/mL BBR对RXR mRNA无显著性影响（P〉0.05）,20、40μg/mL BBR对RXR mRNA有显著的抑制作用（P〈0.05）。结论：黄连素对CYP3A4和P-gp有双向作用,低剂量时诱导,高剂量时抑制,并且其作用很有可能通过PXR信号通路实现。

内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨

目的研究内脏脂肪素(visfatin)对巨噬细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用及其机制。方法体外诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞。为明确visfatin对MMP-9的作用,细胞分为两组:①巨噬细胞+visfatin12h组;②巨噬细胞+visfatin24h组,两组的visfatin的质量浓度均为:0(对照组)、50、100、200、400ng/mL。采用RT-PCR和Westernblotting测定MMP-9基因和蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性。为明确visfatin对MMP-9的作用机制,细胞分为五组:①巨噬细胞未加刺激组(对照组);②巨噬细胞+MAPKp38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1h后加visfatin(200ng/mL)24h组;③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPARγ)天然及人工配体/RXR配体预处理1h后加visfatin(200ng/mL)24h组;④巨噬细胞+visfatin(200ng/mL)24h组(Vis200组);⑤巨噬细胞+visfatin(200ng/mL)刺激不同时间组(5、10、15、30、60min)。Western blotting检测MMP-9蛋白和PPARγ蛋白表达及visfatin刺激下巨噬细胞p38、ERK1/2、JNKMAPK磷酸化水平。结果Visfatin能促进MMP-9基因及蛋白表达(P<0.05,P<0.01),同时增强了MMP-9的活性(P<0.01)。p38MAPK、ERK1/2MAPK通路抑制剂及RXR配体抑制visfatin对MMP-9表达具有上调作用;visfatin能促进p38MAPK和ERK1/2MAPK的磷酸化,但不影响PPARγ蛋白的表达。结论Visfatin增加了巨噬细胞炎症因子的表达,该作用与p38MAPK和ERK1/2MAPK信号通路有关;RXR可能参与了该过程。

9-顺式维甲酸抑制PMA诱导人单核细胞系THP-1表达MMP-9

目的探讨视黄醛X受体(retinoid X receptors,RXRs)特异性激动剂9-顺式维甲酸(9-cisRA)对佛波酯(PMA)诱导人单核细胞系THP-1基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达及活性的影响。方法体外培养THP-1细胞,PMA诱导分化为巨噬细胞,采用9-cisRA对不同浓度PMA组进行干预,应用Realtime-PCR、Westerblotting测定THP-1细胞MMP-9的基因和蛋白水平表达水平,通过Gelatin Zymography法检测MMP-9的酶活性。结果9-cisRA(100nmol/L)对不同浓度PMA组(10、20和40 nmol/L)干预24 h,9-cisRA可明显抑制THP-1细胞MMP-9转录水平,MMP-9的mRNA抑制率分别28%、60%、88%(P<0.01)。MMP-9蛋白水平及酶活性也呈显著下降。结论RXRs特异性激动剂9-cisRA可显著抑制PMA诱导THP-1的MMP-9转录和蛋白水平表达及其酶活性。

中耳胆脂瘤中视黄醛酸β受体与半乳糖凝集素8的表达及其相关性

目的 :探讨视黄醛酸 β受体 (RAR β)及半乳糖凝集素 8(galectin 8)在中耳继发性胆脂瘤上皮的表达 ,阐明这两种因子在胆脂瘤发病机制中的作用。方法 :分别应用免疫组织化学和WesternBlot技术检测RAR β和 galectin 8在 4 2例胆脂瘤和 18例胆脂瘤外耳道皮肤中的表达情况。 结果 :RAR β在 4 2例胆脂瘤上皮各层细胞均存在较强表达 ,定位于胞膜和胞质 ,外耳道皮肤表达较弱 ;两种组织RAR β阳性表达的平均 A值分别为0 .2 734± 0 .0 0 2 2和 0 .0 12 4± 0 .0 0 14 ,差异有统计学意义 (t =34.33,P <0 .0 1)。galectin 8在胆脂瘤上皮组织的浅表层和基底层的表达无明显区别 ,均为胞质和胞膜出现棕黄色颗粒 ,结缔组织中同样如此 ,平均A值为0 .2 82 6± 0 .0 0 16 ;而对照组只有弱阳性表达 ,平均A值为 0 .0 394± 0 .0 0 0 14 ,差异有统计学意义 (t =4 0 .89,P<0 .0 1)。同时我们还比较了RAR β和 galectin 8表达的相关性 ,发现两者的表达高度相关 (P <0 .0 1)。结论 :中耳胆脂瘤可能是一群幼稚未分化的角质细胞无限制地增殖的结果 ;galectin 8的表达水平与RAR

铁离子螯合剂去铁胺上调巨噬细胞、泡沫细胞细胞外基质金属蛋白酶诱导因子表达的机制探讨

目的:探讨铁负荷过低上调巨噬细胞、泡沫细胞细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的机制。研究促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路、视黄醛x受体(RXR)及过氧化物酶体增殖剂活化受体γ(PPARγ)在此过程中的作用。方法:将巨噬细胞和泡沫细胞给予MAPK(p38,ERK1/2)信号通路抑制剂及RXR的天然配体预处理,加入或不加入去铁胺继续培养24 h,用Western blot测定细胞中EMMPRIN蛋白的表达。于巨噬细胞和泡沫细胞中加入铁离子鳌合剂去铁胺刺激,用Western blot检测MAPK(p38,ERK1/2)的磷酸化及PPARγ的水平。结果:p38 MAPK通路抑制剂及RXR和配体在本身不影响EMMPRIN表达的同时,可抑制去铁胺对EMM-PRIN表达的上调。去铁胺可促进p38 MAPK磷酸化,但不影响PPARγ蛋白表达。结论:p38 MAPK参与了铁负荷过低上调巨噬细胞和泡沫细胞中EMMPRIN表达的过程;RXR可能参与了该过程。

六溴环十二烷对视黄醛类X受体α、孕烷X受体、过氧化物酶体增殖物活化受体γ的影响及其相互作用

目的探讨六溴环十二烷(HBCDs)对小鼠神经母细胞瘤细胞N2a增殖的影响以及对3个重要细胞核受体:视黄醛类X受体α(RXRα)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、孕烷X受体(PXR)表达及其相互作用的影响。方法用不同浓度的3种非对映异构体(±)α-HBCD,(±)β-HBCD,(±)γ-HBCD处理N2a细胞,Cell counting kit-8(CCK-8)法检测HBCD对N2a的细胞毒性作用;流式细胞术检测HBCD对N2a细胞周期的影响;实时荧光定量(RT-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot,WB)法分别用于检测3个细胞核受体RXRα、PPARγ、PXR和下游靶基因细胞色素P450亚酶CYP3A11的mRNA及蛋白表达水平的变化;免疫共沉淀技术分析RXRα、PXR、PPARγ受体间的相互作用。结果β-HBCD对N2a的细胞毒性明显大于α-HBCD,γ-HBCD没有明显的细胞毒性。α-HBCD、β-HBCD对N2a细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量效应关系(P<0.05),其半数抑制浓度(IC_(50))分别为60.07和10.52μmol/L,γ-HBCD的细胞毒性较小,镜下可见黑色絮状物,CCK-8法未能测定出其IC_(50);α-、β-HBCD会使细胞周期阻滞在G2/M期;染毒24 h后,RXRα、PPARγ、PXR及CYP3A11的mRNA及蛋白表达水平均呈现上升趋势(P<0.05);在N2a细胞内,α-HBCD染毒前后,RXRα与PPARγ、PXR之间始终存在交互作用关系。结论α-HBCD、β-HBCD对N2a细胞具有增殖抑制作用,细胞周期主要阻滞在G2/M期。α-HBCD、β-HBCD均可诱导3种细胞核受体RXRα、PPARγ和PXR的表达升高,PXR受体下游表达基因CYP3A11的表达也明显升高(P<0.05)。RXRα与PPARγ、PXR三个细胞核受体之间始终存在交互作用,但是受体间相互作用的分子机制有待深入研究。

TLR4/MyD88信号通路介导LPS抑制CYP4X1表达的分子机制研究

目的体外实验探讨细胞色素P4504X1(CYP4X1)在炎性环境下的表达情况及其分子机制。方法人胶质瘤细胞系U251细胞分别给予细菌脂多糖(LPS)联用Toll样受体4(TLR4)抑制剂CLI-095或髓样分化因子(MyD88)的抑制剂ST 2825处理24 h,采用qRT-PCR法检测U251细胞CYP4X1和过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)的表达;采用U251细胞瞬时转染人源PPARγ/核受体视黄醛X受体α(RXRα)表达质粒,双荧光素酶分析实验和染色质免疫共沉淀实验在转录水平上分析PPARγ调控CYP4X1表达的分子机制。结果qRT-PCR结果显示,与空白对照相比,LPS(0.1、1μg/ml)呈剂量依赖性下调CYP4X1(下调38.60%、59.90%,均P<0.05)和PPARγ(下调25.17%、44.44%,均P<0.05)的表达;与单用LPS相比,CLI-095与ST 2825均下调了LPS对CYP4X1和PPARγ表达的抑制作用(均P<0.05)。U251细胞瞬时转染实验显示,与空载组相比,转染组CYP4X1表达上调6.62倍(P<0.05);双荧光素酶分析实验显示,与空载组相比,转染组荧光强度明显上调9.63倍(P<0.05)。染色质免疫共沉淀分析实验显示,与对照组相比,LPS抑制了PPARγ蛋白与CYP4X1启动子的结合,下调65.77%(P<0.05)。结论在U251细胞内LPS通过TLR4/MyD88信号通路抑制了PPARγ与CYP4X1启动子上过氧化物酶体增殖物反应元件的结合,进而在转录水平上抑制了CYP4X1的表达。

药物调控PPAR-γ/RXR-α信号通路对改善丰宫并殖吸虫感染所致大鼠肺损伤的作用

目的探索通过药物调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ/视黄醛X受体α(PPAR-γ/RXR-α)对改善丰宫并殖吸虫感染所致大鼠肺损伤的作用。方法从云南省疫源地采集溪蟹,分离丰宫并殖吸虫后尾蚴,于SD大鼠腹壁皮下注射后尾蚴(8条/鼠),感染大鼠分为高脂饮食组、罗格列酮组、蓓萨罗丁组,每组10只,分别予以高脂饮食(高脂饲料)、罗格列酮[3 mg/(kg•d)]、蓓萨罗丁[10 mg/(kg•d)]灌胃,连续给药7 d,以感染大鼠和健康大鼠分别为感染对照组和健康对照组。首次给药后28 d处死大鼠,取肺组织和心尖血液,制备肺组织切片,HE染色观察肺组织的损伤情况,并进行肺泡炎半定量评分;ELISA检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;提取肺组织总蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测肺PPAR-γ/RXR-α信号通路[PPAR-γ、RXR-α、脂肪酸转运蛋白3(FATP3)、载脂蛋白A1(ApoA1)]、核因子κB(NF-κB)信号通路[p65、激活子蛋白1(AP1)]和janus激酶(JAK)/信号传导及转录激活(STAT)信号通路(JAK2、STAT3)关键靶分子蛋白的相对表达量。多组间比较采用单因素ANOVA分析。结果除蓓萨罗丁组2只大鼠感染失败外,其余大鼠均被感染成功,肺脏可见寄生虫囊包或在胸腔中可查见寄生虫。HE染色显示,感染对照组大鼠肺泡间隔中可见大量炎性细胞浸润,肺泡壁增厚,出现肺泡腔塌陷或闭合;高脂饮食组可见明显炎症损伤,与感染对照组相比较轻,肺泡腔充气略改善;罗格列酮组和蓓萨罗丁组肺泡间隔的炎性细胞较感染对照组明显减少,肺泡壁增厚程度明显减轻,肺泡腔充气明显改善。健康对照组、感染对照组、高脂饮食组、罗格列酮组、蓓萨罗丁组大鼠的肺泡炎半定量评分分别为(0.300±0.053)、(2.200±0.189)、(1.900±0.320)、(1.300±0.301)和(1.500±0.112)分(F=12.033,P<0.05)。ELISA检测结果显示,健康对照组、感染对照组、高脂饮食组、罗格列酮组、蓓萨罗丁组大鼠血清IL-1β水平分别为(103.23±3.37)、(111.59±20.49)、(110.13±12.95)、(89.91±14.84)和(96.34±19.03)pg/ml,TNF-α水平分别为(144.81±1.35)、(180.21±23.38)、(171.76±27.83)、(155.37±13.67)和(143.24±23.66)pg/ml,5组之间差异均有统计学意义(F=17.236、13.558,均P<0.05);其中,感染对照组IL-1β和TNF-α水平均高于健康对照组,罗格列酮组和蓓萨罗丁组低于感染对照组(均P<0.05)。Western blotting检测结果显示,健康对照组、感染对照组、高脂饮食组、罗格列酮组、蓓萨罗丁组大鼠肺组织中,PPAR-γ的相对表达水平分别为0.51±0.09、0.67±0.06、0.75±0.08、0.34±0.02和0.56±0.04,RXR-α分别为0.89±0.05、0.15±0.03、0.81±0.09、0.22±0.02和0.61±0.10,FATP3分别为0.59±0.06、0.64±0.060、0.68±0.09、0.59±0.09和0.55±0.03,ApoA1分别为0.58±0.04、0.83±0.11、0.92±0.19、0.71±0.04和0.63±0.08,5组之间差异均有统计学意义(F=25.70、67.12、8.94、11.58,均P<0.05);p65的相对表达水平分别为0.25±0.19、1.01±0.21、0.27±0.15、0.32±0.01和0.22±0.11,AP1分别为0.11±0.09、1.12±0.36、0.08±0.02、0.03±0.00和0.02±0.01,JAK2分别为0.76±0.18、1.11±0.24、0.34±0.06、0.42±0.01和0.35±0.04,STAT3分别为0.80±0.33、1.11±0.27、0.68±0.22、0.77±0.06和0.68±0.19,5组之间差异均有统计学意义(F=43.77、85.19、37.22、17.63,均P<0.05)。其中,感染对照组PPAR-γ、FATP3、ApoA1、p65、AP1、JAK2和STAT3的相对表达水平高于健康对照组,罗格列酮组和蓓萨罗丁组低于感染对照组;感染对照组RXR-α的相对表达水平低于健康对照组,高脂饮食组、罗格列酮组和蓓萨罗丁高于感染对照组(均P<0.05)。结论建立了丰宫并殖吸虫感染大鼠肺损伤模型,药物调控PPAR-γ/RXR-α信号通路可通过抑制NF-κB和JAK/STAT信号通路发挥抗炎作用,减轻肺损伤的严重程度。

桥本甲状腺炎的B超表现及患者外周血Th17细胞水平的检测

目的：通过检测桥本甲状腺炎（HT）患者外周血单个核细胞（PBMC）Th17特异性转录因子等的mRNA水平及观察患者B超表现，并与健康者对照，为HT的诊断提供新思路。方法：用超声检查观察74例确诊HT患者甲状腺形态及内部回声改变，测量甲状腺各径线大小，彩色多普勒血流成像（CDFI）技术观察其血流信号分布状况；应用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术检测患者及健康对照者PBMC中白细胞介素17（IL-17）和视黄醛酸相关孤儿核受体（ROR,yt）的mRNA水平。结果：92％的HT患者甲状腺呈弥漫性增大，以前后径及峡部增厚为特征，内部回声以弥漫性减低为主，血流信号多表现为轻～中度增多。HT患者PBMC中IL-17和RORγt mRNA的表达水平均明显高于健康对照者（P〈0．01）。结论：甲状腺B超检查联合外周血Th17及RORγt检测，可以提高HT的检出率。