紫外辐射对皮肤角化细胞的影响及其防护的研究

利用紫外线照射人皮肤角化细胞 ,采用流式细胞技术观察细胞周期的进程和细胞凋亡情况 ,并研究了人参皂甙单体Rg -1和Rb -1对紫外辐射的保护作用。结果表明一定剂量的紫外线可明显诱导人皮肤角化细胞S期阻滞及细胞凋亡 ,人参皂甙单体Rg -1和Rb -1能够释放S期阻滞、抑制细胞凋亡 ,对细胞的紫外辐射损伤具有不同程度的保护作用 。

转化生长因子β对口腔粘膜角化细胞增殖的影响

目的:探讨转化生长因子(TGF－β)对口腔粘膜角化细胞增殖分化的调控作用及其机制。方法:对人口腔粘膜上皮角化细胞(KC)进行分离,传代培养和鉴定,加入含有不同质量浓度的 TGF－β培养液培养3 d,然后用四唑盐(MTT)比色试验检测TGF－β对 KC增殖状况的影响。结果:体外培养 KC呈多角形,胞浆内有丰富的张力细丝,表面有大量微绒毛,角蛋白抗体免疫组化呈阳性。TGF－β在一定的浓度范围内对KC的增殖起抑制作用。结论:TGF－β对体外培养的KC增殖有抑制作用。

人IL-31的克隆表达及对表皮角化细胞的影响

目的克隆人IL-31基因,构建真核表达载体,研究人IL-31对表皮角化细胞HaCaT的影响及其作用机制。方法PMA、PHA刺激正常人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-31基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,进行PCR和双酶切鉴定,并进行序列测定。将重组质粒转染CHO细胞,用RT-PCR和Western blot分析rhIL-31在CHO细胞中的表达。用Ni2+树脂纯化his融合蛋白,用不同剂量rhIL-31刺激HaCaT细胞,利用Transwell穿孔板检测HaCaT细胞培养上清对外周血单个核细胞的趋化作用,荧光定量PCR检测rhIL-31对HaCaT表达趋化因子的影响,Western blot检测STAT3磷酸化。结果成功获得全长人IL-31基因,测序正确,经双酶切、PCR和序列测定鉴定,真核表达质粒构建正确,可在CHO细胞中表达;该目的蛋白刺激人表皮角化细胞HaCaT,细胞培养上清对外周血单个核细胞有趋化作用,HaCaT细胞表达趋化因子MDC、TARC、I-309;细胞STAT3磷酸化增加。结论IL-31作用于正常人表皮角化细胞,细胞培养上清对外周血单个核细胞有趋化作用,HaCaT细胞趋化因子表达增加,细胞STAT3磷酸化增加,提示IL-31可通过STAT3发挥作用。

角化细胞生长因子的获得及植物表达载体的构建

从鼠肺中提取RNA,设计相应的引物,经RT PCR扩增出角化细胞生长因子cDNA序列;插入pMD18 T载体,经DNA测序证实为KGF基因.将KGF基因经酶切后连接于植物CaMV35S启动子和NOS终止子之间,单酶切插入pBI1301植物双元表达载体,转化大肠杆菌,阳性克隆提取质粒后转化农杆菌EHA105,实现KGF植物表达载体的构建,为KGF的进一步研究奠定基础.

角化细胞生长因子在食管鳞状细胞癌中的表达

目的研究食管鳞状细胞癌(ESCC)中角化细胞生长因子(KGF)的表达,并分析其与患者临床病理特征的关系。方法选择2013年1月至2014年6月新乡医学院第一附属医院胸外科行ESCC根治切除术的患者56例,其手术切除食管病变部位的食管癌组织为ESCC组,同时选择其中25例ESCC切除标本上、下断端(距肿瘤边缘>5 cm)的正常食管上皮作为对照组。采用免疫组织化学方法观察、评定2组KGF表达的阳性率及表达强度,并进行比较。分析KGF表达与标本来源患者临床病理参数的关系。结果 ESCC组KGF的阳性表达率(57.1%)显著高于对照组(4.0%)(P<0.05)。ESCC组织中KGF蛋白的表达与有无淋巴结转移和分化程度有关(P<0.05),与患者的性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、TNM分期及大体分型无关(P>0.05)。结论 KGF可能在ESCC的发生、发展中起重要作用,检测KGF表达对食管鳞状细胞癌的诊断、判断预后有重要参考价值。

角化细胞生长因子对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肺泡上皮细胞的实验研究

目的观察角化细胞生长因子(KGF)对体外小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肺泡上皮细胞诱导分化的影响。方法建立体外非接触共培养诱导小鼠MSCs向肺泡上皮细胞分化的实验模型,并在培养液中加入KGF(10μl/ml),小鼠分4组(6只/组),实验组A:MSCs(1×105)单独培养组+KGF;实验组B:MSCs+正常肺组织悬液(1×105)+KGF;实验组C:MSCs+损伤肺组织悬液+KGF;实验组D:MSCs+损伤肺组织悬液(1×105)。共同培养8 d,应用激光共聚焦显微镜和RT-PCR检测共培养体系下室MSCs中的SP-C和AQP5的表达情况。结果实验组C于共培养的d 8,较其它实验组的AQP5 mRNA的表达量明显增多(5550.00±244.39vs1650.17±184.02,1600.83±193.00,2890.00±179.09,P均<0.05);于共培养的d 5,与实验组A相比差异也有统计学意义(1743.17±228.41vs1482.00±156.11,P<0.05)。只有实验组C和D表达SP-C,且实验组C各培养时间点的SP-C的mRNA的表达量均较实验组D明显增多(2632.50±231.11vs1599.00±158.95;3976.67±221.81vs2066.83±101.31;5388.33±347.96vs3893.17±178.61,P均<0.01)。结论KGF可以进一步促进体外小鼠MSCs诱导分化为肺泡上皮细胞。

脂质体介导端粒酶基因转染人口腔黏膜角化细胞的实验研究

目的:将端粒酶基因转染入人正常口腔黏膜角化细胞,观察人端粒酶反转录酶(hTRT)的表达情况。方法:采用脂质体LipofectAMINE 2000与转铁蛋白共同将含有hTRT基因的pEGFP-hTRT质粒转染人正常口腔黏膜角化细胞,经荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察荧光,并进行流式细胞仪检测转染效率,采用RT-PCR检测转染细胞中外源性hTRT的表达,并经G418筛选观察其稳定表达情况。结果:LipofectAMINE 2000与转铁蛋白共同将pEGFP-hTRT转染入人正常口腔黏膜角化细胞,转染率为15.34%,转染细胞表达外源性hTRT。结论:脂质体LipofectAMINE 2000与转铁蛋白成功介导含有端粒酶基因的pEGFP-hTRT质粒转染人口腔黏膜角化细胞。

不同年龄人角化细胞的衰老特征评价

目的评价年龄对衰老细胞模型的影响,以建立体外培养的衰老细胞模型。方法本研究根据供者年龄分为4组,每组3例生物学重复,<10岁、10～20岁、20～30岁和>30岁组。酶消化法体外分离培养不同年龄供体的表皮角化细胞。体外培养至P2代,进行以下检测:β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞数量;CCK-8和克隆形成试验检测细胞生长和增殖能力;磷酸化γ-H2A.X免疫荧光染色检测细胞DNA损伤;Western blot法检测分析细胞中周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白表达。结果各组衰老细胞数占总细胞数百分比分别为0.864%、0.789%、5.472%、8.765%,差异有统计学意义(P=0.000)。随着年龄的增加,HKCs细胞倍增能力下降,倍增时间延长。<10岁组中细胞核Phospho-Histone H2A.X表达细胞数量少,>30岁组人正常角化细胞内DNA双链断裂大量产生。同时,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))、p21、p53的表达随年龄增加而上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论正常人角化细胞的增殖与衰老与人类年龄呈显著正相关,可以作为研究人类衰老的细胞模型。

复合角化细胞人工皮肤的实验研究——小香猪角化细胞库的构建

目的小香猪皮肤角化细胞常作为种子细胞运用于多种生物复合材料中,本研究旨在通过对小香猪角化细胞获取、培养及传代的研究,为生物膜修复皮肤缺损奠定基础。方法采用中性蛋白酶和胰蛋白酶联合消化法分离小香猪角化细胞,然后接种、传代,观察角化细胞形态,并绘制生长曲线。同时,将角化细胞进行冻存与复苏,观察其特性。结果小香猪角化细胞呈"铺路石"样生长,可连续传代,第1代到第4代保持了旺盛的增长趋势,且细胞形态良好,与原代细胞无明显区别,第5代之后细胞生长缓慢,不宜传代。冻存、复苏后的角质形成细胞保持了与原代细胞相同的生长状态,并具有继续传代能力。从细胞生长曲线上可以看出角化细胞的生长过程经历了潜伏期、指数生长期、停滞期三个阶段。结论小型香猪角质细胞库的构建为组织工程化皮肤的临床应用奠定了前期基础。

大鼠表皮角化细胞增殖活性的拓扑学特点

目的 研究大鼠前肢表皮细胞增殖活性的拓扑学分布特点及其与经脉体表循行线的关系。 方法常规石蜡切片 ,利用核仁组织区银染法和增殖细胞核抗原 (PCNA)免疫组织化学法 ,分析表皮细胞核中银粒的面积密度和PCNA阳性细胞核的百分率。 结果 在所研究的范围内 ,表皮细胞的增殖活性在水平方向上随部位而异 ,增殖活性不同的表皮细胞各自聚集成群 ,其大小约为 10 - 3m数量级 ,并在纵向上形成 3或 4条低增殖活性的细胞带 ;从比较解剖学看 ,这些部位相当于大鼠前肢上 3或 4条经脉体表循行线所经过的位置。

大鼠表皮角化细胞Cx43表达和细胞增殖活性的关系

目的 :研究大鼠前肢表皮角化细胞Cx43的表达和细胞增殖活性的拓扑学分布特点及二者间的关系。方法 :常规石蜡切片 ,利用Cx43和增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen ,PCNA)免疫组化法 ,分析单位面积表皮细胞中Cx43表达的长度 (LA)和PCNA阳性细胞核的百分率。结果 :在水平方向上 5mm范围内 ,表皮细胞Cx43的表达随部位而异 ,且在距离始端大约 3.0～ 4.5mm处Cx43表达丰富。同时 ,在水平方向上 10mm范围内 ,角化细胞的增殖活性随部位而异 ,且增殖活性类似的角化细胞各自聚集成群 ,其直径大小约为 10 -3 m数量级 ;并在距离始端约 3.0～ 4.0mm处是角化细胞增殖活性低的位置。结论

高氧对早产大鼠角化细胞生长因子mRNA及增殖细胞核抗原表达的影响

目的 探讨 85 %高浓度氧暴露对早产新生大鼠肺组织角化细胞生长因子 (KGF)mRNA及增殖细胞核抗原 (PCNA)动态表达的影响。方法 早产SD大鼠生后 1d随机分为空气组、高氧组。高氧组持续暴露 85 %氧气中 ,空气组置于同一室内常压空气中。两组分别于 1、4、7、10、14和 2 1d时 ,提取肺组织RNA ,采用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定KGFmRNA ;同时应用免疫组化检测肺组织切片中PCNA。结果 (1)与空气组相比 ,高氧 1d时 ,KGFmRNA表达无明显差异 (P >0 0 5 ) ;4d时明显增强 ,较空气组增加 3 8倍 (P <0 0 0 1) ;其后开始下降 ,7d时较空气组增加 1 8倍 (P<0 0 5 ) ;10d时两组间无明显差异 (P >0 0 5 ) ;14d时较空气组降低 1 5倍 (P <0 0 1) ,2 1d时复又增高 ,较空气组增加 1 15倍 (P <0 0 1)。 (2 )空气组早产新生大鼠生后 14d内肺组织中均有PCNA表达 ,并且PCNA阳性细胞 90 %以上定位于气道和肺泡上皮细胞 ,2 1d时几乎检测不出其表达 ;与空气组比较 ,高氧组 1～ 4d时肺组织中PCNA表达明显减弱 ,7～ 10d时增强且部分间质细胞也有表达 ,2 1d时PCNA阳性细胞以间质细胞为主。结论 85

反转录病毒介导端粒酶基因对人口腔黏膜角化细胞寿命的影响

目的：以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因（hTRT）转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法：将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性。结果：获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8~9代。结论：转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因。

体外培养口腔黏膜角化细胞生物学的特性

目的一个稳定的人类正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系对于研究组织工程化口腔黏膜构建及口腔黏膜上皮癌变及阻断有重要意义。研究体外培养的人正常口腔黏膜角化细胞的细胞生物学特性。方法通过测定细胞生长曲线及克隆形成率了解细胞生长基本规律及其增殖能力,并通过流式细胞仪检测细胞染色体倍性。结果细胞接种后第1～3天为静止生长期,第5～10天处于对数生长期,第12天后进入平台期。倍增时间为24～48h;接种密度为200/cm2时,培养细胞克隆形成率为0.979%。经流式细胞仪检测细胞染色体倍性结果表明原代及传代细胞均为二倍体细胞。结论体外连续培养的口腔黏膜角化细胞为正常上皮细胞,增殖能力良好。

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1(KGF-1)编码区序列,构建真核荧光表达载体。方法从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录PCR获取KGF-1cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定。将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞(marrow stroma cells,MSCs)48h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达。结果构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致。KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内。结论成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础。

电离辐射诱导人正常角化细胞衰老死亡的作用机制研究

目的研究电离辐射对人正常角化细胞的影响,探讨放射治疗引起口腔黏膜炎的可能作用机制。方法原代培养正常人角化细胞在5 Gy辐射后,SAβ-Gal染色法检测细胞衰老情况,CM-H2DCF-DH染色法检测细胞活性氧产生情况,实时荧光定量PCR检测氧化酶基因表达情况,γ-H2AX免疫荧光染色检测细胞DNA修复能力。结果电离辐射可引起人正常角化细胞衰老死亡,细胞内活性氧大量产生,氧化酶基因表达明显增高,细胞DNA双链断裂。结论电离辐射引起的正常角化细胞衰老死亡与活性氧产生和DNA损伤有关,这可能是放射治疗引起口腔黏膜炎的作用机制之一。

角化细胞生长因子、磷酸化酪氨酸在慢性化脓性中耳炎中的表达及意义

目的:研究鼓膜穿孔部位邻近皮肤中角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)、磷酸化酪氨酸表达在慢性化脓性中耳炎不同转归中的作用。方法:应用免疫组化SP染色方法和多媒体图像分析系统,观察20例中耳胆脂瘤患者鼓膜穿孔部位邻近皮肤中的KGF和磷酸化酪氨酸表达,并与其耳道深部正常皮肤和非胆脂瘤型中耳炎鼓膜穿孔部位邻近皮肤比较。结果:胆脂瘤型中耳炎鼓膜穿孔部位邻近皮肤KGF、磷酸化酪氨酸表达的平均光密度值分别为0.374±0.039和0.248±0.009,显著高于耳道深部正常皮肤和非胆脂瘤型中耳炎鼓膜穿孔邻近皮肤。结论:角化细胞生长因子、磷酸化酪氨酸可能在胆脂瘤型中耳炎的发生中起了一定的作用。

大熊猫阴道角化细胞变化的连续监测

对一只旅居美国的青年雌性大熊猫在休情期和发情期的阴道角化细胞变化作了连续监测 .结果表明 :休情期间低于 35 % ,发情期间平均高于 80 % .当角化率上升到 70 %左右时 ,提示动物发情期开始 ;上升至 90 %左右 ,表明已进入发情高潮期 ,是配种良机 .其结果与尿激素水平和行为表现相比较 ,三者具有高度一致性 ,证明阴道角化细胞变化监测对判定大熊猫的发情及配种时机具有良好的指示意义 .

高氧、维甲酸对胎鼠肺角化细胞生长因子及其受体表达的影响

目的 探讨高氧、维甲酸 (RA)对胎鼠肺成纤维细胞 (LFs)和肺泡II型上皮细胞 (AECII)角化细胞生长因子 (KGF)及其受体 (KGFR)表达的影响。方法 原代培养胎鼠肺LFs及AECII ,待生长至亚汇合状态时 ,随机分为 :空气组 ,空气 +RA组 ,高氧组 ,高氧 +RA组。于培养 2、6、12、2 4、4 8(AECII)和 72h(LFs)时 ,采用半定量RT -PCR方法检测KGF和KGFR的mRNA表达。结果 与空气组比较 ,高氧 2h时 ,胎鼠LFsKGFmRNA表达即明显下降 ,6h时达极点 ,以后下降趋势逐渐减弱 ,至 4 8h后已无显著性差异 ;高氧 2、6、12和 2 4h时 ,其下降幅度分别为 3 0、5 2、2 3和 2 1倍 (P <0 0 5、0 0 1、0 0 1和 0 0 5 )。RA可上调高氧状态下胎鼠LFsKGFmRNA表达 ,与高氧组比较 ,高氧 +RA组在 2、6、12和 2 4h时KGFmRNA表达分别是高氧组的 2 4、3 4、1 7和 1 8倍 (P <0 0 5、0 0 1、0 0 1和 0 0 5 )。高氧对胎鼠AECIIKGFRmRNA表达影响较小 ,与空气组比较 ,仅在高氧 12h和 2 4h时其表达量分别是空气组的 2 3和 1 3倍 (P <0 0 5 ) ;RA对AECIIKGFRmRNA表达没有影响。