共焦显微镜引导下取材行人角膜缘上皮干细胞的体外培养及鉴定

背景目前严重的致盲性眼表疾病的治疗方法主要是自体或异体角膜缘干细胞移植，但存在着供体材料来源有限、术后免疫排斥等问题。体外培养角膜缘干细胞用于成为研究热点，优化其培养方法是提高培养效率的前提。目的以共焦显微镜作为指导进行取材，对人角膜缘干细胞进行体外培养和鉴定，为构建人角膜缘干细胞植片奠定基础。方法应用激光扫描共焦显微镜对10例10眼白内障术前检查的患者行全角膜及角膜缘分区扫描，记录角膜及角膜缘上皮层、前弹力层图像，对所有检查资料进行研究分析。依据共焦显微镜对角膜缘上皮层的结构分析，对眼库提供的正常供体角膜缘组织进行取材，实验共分6批取组织进行培养，共接种103张组织块。用组织块培养法、以羊膜为载体进行体外培养，分别在培养的第5天、第10天利用免疫荧光技术检测p63蛋白、细胞角蛋白19（CKl9）和角蛋白3（K3）及involuerin蛋白的表达对培养细胞的表型进行鉴定。结果共焦显微镜扫描显示，角膜缘上皮层细胞聚集成细长条索，呈栅栏状外观，其间可见大量高反光颗粒状物质；在基底部扫描时观察到“细胞岛”样现象；角膜缘部位斜切面观察可见上皮层下有排列整齐的乳头状突起。接种的103块组织块中出膜生长74块，平均出膜率为（68．62±16．94）％，平均出膜时间为（5．83±2．04）d，第3批和第6批组织块的出膜率明显高于第2批和第4批，差异均有统计学意义（P〈O．05）。第4批和第6批组织块的出膜时间明显长于第1、2、3、5批，差异有统计学意义（P〈0．05）。在培养的第5天和第10天，角膜缘干细胞表达p63蛋白的阳性细胞比例分别为4．05％和36．52％，CK19阳性细胞比例分别为26．07％和40．55％，K3的阳性细胞比例分别为57．88％和40．81％，表达involucrin蛋白的阳性细胞比例分别为64．66％和59．19％。结论在共焦显微镜引导下选取角膜缘组织进行角膜缘干细胞培养结果可靠，羊膜作为载体可以使体外培养的人角膜缘干细胞良好生长。