人胚胎干细胞来源角膜上皮样细胞用于治疗兔角膜缘干细胞缺乏

目的 通过小分子化合物诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分化为角膜上皮样细胞,观察角膜上皮样细胞治疗兔角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)的效果。方法 利用拟胚体联合小分子化合物方法,将hESCs H9细胞系向角膜上皮样细胞分化,将角膜上皮样细胞在去上皮羊膜片上培养构建重组细胞膜片。选取造模成功的12只LSCD兔,按照随机数表法分为对照组和实验组,对照组接受去上皮的的羊膜片治疗,实验组接受角膜上皮样细胞膜片移植治疗。术后通过裂隙灯、前节照相等方法,对角膜透明度、新生血管、荧光素钠染色情况进行评分,并于移植后4周观察角膜病理切片结构。结果 成功将hESCs诱导为角膜上皮样细胞,细胞形状和结构类似角膜上皮细胞。病理结果显示,实验组的角膜形成复层上皮结构,上皮下炎症细胞浸润轻,治疗效果明显优于对照组。进行细胞移植治疗后发现,实验组的角膜透明度高、新生血管少,角膜评分明显优于对照组(P<0.05)。诱导后的角膜上皮样细胞的角膜上皮标记物ΔNP63和CK12的表达与hESCs H9相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 采用拟胚体联合小分子化合物可以成功诱导出角膜上皮样细胞,角膜上皮样细胞膜片移植到兔体内后可有效治疗LSCD。

聚乳酸支架材料与角膜上皮样细胞的体外生物相容性

目的观察聚乳酸支架材料与角膜上皮样细胞的体外生物相容性。方法通过热压法与流延法分别制作聚乳酸支架材料。复苏培养前期实验获得的角膜上皮样细胞,免疫荧光化学法鉴定,将第三代角膜上皮样细胞分别种植于上述2种聚乳酸支架材料,显微镜下观察此两种支架材料上细胞的存活与生长情况;采用伊红染色观察支架材料上细胞数量与形态,噻唑蓝法检测细胞活力。结果热压法聚乳酸支架材料为纤维交织立体结构,而流延法材料为实性结构,无孔隙。细胞种植于支架材料后,细胞种植4d后镜下可见热压法聚乳酸支架材料组大量细胞存活,且紧贴着支架材料生长并向支架材料内伸展,伊红染色可见材料上大量着色的细胞;流延法组细胞存活极少,伊红染色仅见极少细胞附着在材料上。结论热压法聚乳酸支架材料具备纤维孔隙结构,支持角膜上皮样细胞的存活与生长,具备与角膜上皮样细胞有较好的生物相容性,有进一步开发角膜上皮样细胞移植支架的前景。

人脂肪组织来源的干细胞体外诱导为角膜上皮样细胞的分化潜能

目的初步探讨人脂肪组织来源的干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSC)体外诱导为角膜上皮样细胞的分化潜能。方法分离、纯化、体外扩增hADSC,流式细胞术鉴定所获得细胞的CD29+、CD34-、CD49d+、CD105+、CD106-的表达情况。成脂、成骨诱导鉴定其多向分化潜能。在DMEM/F12体系、KM体系及上述二者等体积混合的KM/DMEM/F12体系内添加不同梯度浓度的生长因子对hADSC进行体外诱导:0μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1、50μg·L-1的表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF),及50μg·L-1EGF+10μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子(basicfibro blast growth factor,bFGF)和50μg·L-1EGF+20μg·L-1bFGF。连续诱导21d,观察hADSC形态学的改变及第21天时角膜特异性蛋白AE5(CK3/CK12)的免疫化学表达情况,比较不同培养体系及不同浓度生长因子对hADSC诱导作用的差异。结果流式细胞仪测定传3-5代的细胞CD34-、CD106-、CD29+、CD49d+、CD105+。成脂、成骨体外诱导14d后,油红O、碱性磷酸酶染色阳性率分别为74.6%和29.3%。KM体系中加入终浓度为0～50μg·L-1EGF诱导21d后,hADSCAE5阳性细胞率均占90%以上。其中,40μg·L-1EGF诱导下的AE5阳性细胞率为98.7%,50μg·L-1EGF可达到100%。而加入bFGF的hADSC则为AE5弱阳性。而另2个体系对各浓度EGF、bFGF诱导的hADSC的作用均为阴性。结论人吸脂术废弃液中可获得大量高纯度脂肪组织来源的干细胞,经体外条件诱导具备向角膜上皮样细胞分化潜能。添加EGF的角质细胞培养液有利于其分化,并具有浓度依赖性,bFGF则对分化有抑制性作用。

Pax6基因转染对脂肪来源间充质干细胞的诱导分化研究

目的 探讨应用Pax6基因转染诱导脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）分化为角膜上皮样细胞的可行性。 方法取健康5～6周龄C57BL/6小鼠双侧腹股沟脂肪，分离、培养ADMSCs，取第3代细胞进行基因转染。设未转染组（A组）、pcDNA3.1空质粒组（B组）和pcDNA3.1-Pax6重组质粒组（C组），转染48 h后取B、C组进行G418筛选，倒置显微镜下观察细胞形态学改变；Western blot检测各组Pax6蛋白以及角膜上皮细胞特异性标志分子——细胞角蛋白12（cytokeratin 12，CK-12）表达；实时荧光定量PCR检测各组CK-12 mRNA表达。 结果A、B组细胞形态无改变；C组筛选出两类不同形状的细胞克隆，一类呈“铺路石”状，形态类似角膜上皮细胞，命名为筛选克隆1；另一类呈网状，有3～7个细胞突起，命名为筛选克隆2。Western blot检测示，A、B组Pax6蛋白表达均为阴性，C组两类细胞克隆均有Pax6蛋白表达；仅C组筛选克隆1 CK-12蛋白表达为阳性，其余3组均为阴性。实时荧光定量PCR检测示，C组筛选克隆1的CK-12 mRNA相对表达量为8.64 ± 0.73，高于筛选克隆2（0.55 ± 0.42）、B组（1.36 ± 0.40）和A组（1.00 ± 0.00）（P 〈 0.05）；A、B组以及C组筛选克隆2比较差异均无统计学意义（P 〉 0.05）。 结论Pax6基因转染能够诱导小鼠ADMSCs分化为角膜上皮样细胞，同时促进CK-12表达，为组织工程角膜构建提供了一种有效的上皮细胞来源。