体外重建角膜上皮组织的实验研究

目的利用体外培养重建同基因角膜上皮组织的新方法，为角膜化学伤后重建角膜表面提供理想的角膜上皮移植片。方法以同种或异种脱水保存的浅层角膜基质片作为载体，通过体外培养自体角膜缘上皮细胞，并使其在体外形成复层角膜上皮组织。结果经组织学、细胞超微结构的观察，以及细胞分化蛋白表达的检测，证实体外培养的角膜上皮组织与生理状态下的角膜上皮组织相近。结论体外培养的角膜上皮组织片可作为较理想的角膜上皮移植材料。

以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织

目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。

一种基于胚胎干细胞构建角膜上皮样组织的新方法

目的利用Rock抑制剂联合低氧-常氧培养方式构建基于胚胎干细胞(ESCs)的组织工程角膜上皮。方法应用贴壁培养作为分化方式,用全反式维甲酸(RA)+骨形态发生蛋白4(BMP4)诱导人源ESCs细胞系H1向角膜上皮样细胞分化。以SHEM与KSFM培养基1∶2混合配比作为扩增基础培养基,分别添加或不添加Rock抑制剂Y27632,扩增ESCs来源的角膜上皮样细胞。将诱导后的角膜上皮样细胞接种于去上皮羊膜载体上,在低氧、常氧、低氧-常氧相结合等不同条件下构建组织工程角膜上皮。通过形态学、实时荧光定量PCR反应(RTFQ-PCR)、免疫荧光法检测诱导效果、ESCs来源角膜上皮样细胞的扩增能力及组织工程角膜上皮表型。结果与对照组比较,诱导组诱导后8 d ESCs标志物Oct4 mRNA,Notch信号通路相关因子Notch1、Jagged1 mRNA以及Wnt信号通路的相关因子c-myc和Cyclin D1 mRNA的相对表达量显著降低,表皮外胚层标志物p63和K18 mRNA的相对表达量显著增加,差异均有统计学意义(t=14.63、20.15、93.50、11.60、19.30、18.44、22.63,均P<0.05)。与Y27632未添加组相比,Y27632添加组细胞的p63、K14 mRNA相对表达量以及Notch信号通路受体Notch1和Jagged1 mRNA相对表达量显著升高,Wnt信号通路下游靶向基因c-myc和CylinD1 mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(t=20.29、59.22、2.90、39.59、5.32、10.14,均P<0.05);2个组K18 mRNA的相对表达量无明显变化,差异无统计学意义(t=1.38,P>0.05)。Y27632添加组用低氧-常氧相结合的方式构建ESCs来源的上皮片较持续低氧或常氧培养复层化更明显,排列更紧密,并全层表达上皮细胞标志物Pan-CK和K18及上皮干细胞标志物p63和K14。结论Y27632的添加可增加ESCs来源角膜上皮样细胞的增生能力,激活Notch信号通路,抑制Wnt信号通路。采用低氧-常氧相结合的方式,利用添加Y27632的培养基扩增构建ESCs来源的组织工程角膜上皮有助于上皮片的复层化。

原代培养冷冻兔角膜缘上皮细胞的增殖活性研究

为探讨低温保存的兔角膜缘上皮细胞体外培养方法和增殖活性,采用不同的冷冻条件保存兔角膜缘上皮组织;通过若丹明B染色方法定量检查体外培养的原代细胞增殖活性,并对含血清培养和无血清培养、消化培养和组织块培养进行比较性研究。结果表明,二甲基亚砜浓度梯度和降温速率对冷冻角膜缘上皮原代细胞的增殖能力均无显著性影响(P>0.05)。在细胞增殖活性上,血清培养组优于无血清培养组(P<0.05); 组织块培养组优于消化培养组(P<0.05);RPMI 1640组优于MEM组和DMEM组(P<0.05);3T3细胞滋养层组与臣噬细胞滋养层组结果相似(P>0.05)。结论:兔角膜缘上皮细胞具有血清依赖性和低温耐受性。

翼状胬肉切除术联合滑行结膜角膜瓣移植术

目的 探讨复发性翼状胬肉手术的新方法。方法 对 17例 (18只眼 )复发性翼状胬肉 ,先在其角膜上、下缘作带有角膜缘干细胞的结膜角膜瓣 ,再移植到切除胬肉的巩膜创面上 ,缝合固定。结果 术后局部反应轻微 ,刺激症状小 ,随访 6～ 2 4个月 ,无一例复发。

西藏地区翼状胬肉切除联合自体角膜缘上皮组织移植的临床观察

翼状胬肉是眼科常见病和多发病，特别是在西藏高原地区（海拔在3000 m以上），由于紫外线照射及风沙、气候干燥等原因引起结膜慢性炎性反应可能使角膜缘上皮组织受损而发病率高。手术是目前主要治疗方法，其中术式的选择尤为重要，因为手术治疗必须达到3个主要的目的（1）应安全地将胬肉切除干净。（2）达到良好光学效果。（3）避免复发。治疗翼状胬肉的传统方法很多，但复发率较高， Vaniscotte曾于1986年报道不同手术方法的成功率：单纯切除一次成功率为59%，切除加球结膜移植为82%，切除加自体结膜转移为87.5%[1]。

糖尿病外周神经炎合并单纯疱疹病毒性角膜炎一例

患者男,62岁.左眼红痛,流泪,视物不清1个月,加重10天来我院眼科就诊.眼科检查：视力：左0.2、右1.0;双眼眼内压Tn.裂隙灯检查示：左眼睫状充血,角膜水肿,中央约3 mmx6 mm地图状溃疡灶,房闪（-）,KP（-）,未见后弹力层皱褶及前房积脓,眼底窥不清（图1A）.角膜共聚焦检查示：上皮细胞可见片状坏死区、反光增强,无明显细胞结构;上皮下树突状细胞增多;浅基质层细胞增大呈激活状态,可见局部溃疡坏死;内皮细胞形态密度大致正常;角膜基底神经丛神经纤维密度降低,异常肿大扭转、排列杂乱（图1B）.单纯疱疹病毒（HSV）单克隆抗体间接免疫荧光检测角膜上皮组织刮片证实,HSV（＋）.综上诊断：＂单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）上皮型＂.予1％（1/100）更昔洛韦滴眼液点眼,每日4次,连续2周.