力学刺激对角膜成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的研究在体及离体条件下不同力学环境对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bF-GF)表达的影响,探索力学因素在准分子激光原位角膜磨镶术(laser assisted in situ keratomileusis,LASIK)术后角膜损伤修复中的作用。方法建立不同切削量的LASIK手术动物模型,使在体角膜处于不同力学环境中,并于LASIK术后1周和1月处死实验动物提取组织蛋白。此外,采用Flexcell 4 000细胞力学加载系统对原代提取的兔角膜成纤维细胞施加频率为0.1 Hz、拉伸幅度分别为5%、10%和15%的周期性机械拉伸,并于拉伸后6 h和24 h后取细胞培养液上清。采用ELISA方法检测bFGF含量。结果 LASIK术后1周,角膜基质床残余30%组与对照组相比,bFGF含量显著增高(P<0.05);术后1月回落至正常水平,各组之间无显著性差异。不同时间点同一手术方式之间比较发现,仅30%组1周和1月有显著差异(P<0.05)。体外周期性拉伸实验表明拉伸6 h后1,5%拉伸组bFGF含量较对照组显著增高(P<0.05)2,4 h后显著性降低(P<0.05)。结论力学因素参与了早期角膜组织及角膜成纤维细胞bFGF表达的调节,bFGF在LASIK术后角膜组织修复中发挥了一定作用。

CTGF对角膜成纤维细胞生物学功能的影响

目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的角膜成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞转化和合成细胞外基质的影响。 方法 体外培养兔角膜成纤维细胞,经0.5、5、50和500 ng／mL CTGF处理24 h后,分别进行增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色、银染核仁组成区染色(AgNOR)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组化染色以及Ⅲ型胶原(CA-Ⅲ)、纤维连接蛋白(FN)和层黏蛋白(LM)免疫组化染色,检测CTGF对角膜成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞转化和细胞外基质合成的影响。 结果 与对照组相比,0.5、5、50和500 ng／mL的CTGF能剂量依赖性地促进角膜成纤维细胞PCNA表达,增加核仁银染颗粒数,促进α-SMA的表达,同时能促进角膜成纤维细胞CA-Ⅲ、FN和LM的合成(P<0.01)。结论 一定质量浓度的CTGF可能在角膜损伤修复过程中发挥重要作用。

羊膜对角膜成纤维细胞CTGF表达及凋亡的影响

目的观察羊膜对在其基质面生长的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达以及凋亡的影响。方法将传代的家兔角膜成纤维细胞接种于羊膜基质面,培养5d后,用RT-PCR检测角膜成纤维细胞CTGFmRNA表达的变化;用流式细胞仪观察羊膜对IL-1诱导的角膜成纤维细胞凋亡的影响。结果在羊膜基质面培养的角膜成纤维细胞,其CTGF/GAPDH像素比值较对照组低,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05);羊膜能降低IL-1诱导的角膜成纤维细胞凋亡率,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.01)。结论羊膜不仅抑制体外培养的角膜成纤维细胞CTGFmRNA的表达,而且能抑制角膜成纤维细胞的凋亡,可能部分解释羊膜减轻角膜基质损伤修复反应和抗眼表瘢痕形成的机制。

机械牵张对兔角膜成纤维细胞细胞外基质基因表达的影响

目的研究机械牵张与白介素-1β(IL-1β)联合作用对兔角膜成纤维细胞细胞外基质相关基因表达的影响。方法对原代提取的兔角膜成纤维细胞进行牵张幅度15%、频率0.1 Hz的周期性牵张12、24、36 h,同时给予IL-1β处理,采用实时荧光定量PCR检测细胞基质金属蛋白酶(MMPs)、基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP-1)和I型胶原α1(Collagen Iα1)mRNA表达变化水平。结果 IL-1β单独作用可以诱导角膜成纤维细胞MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA表达;MMP-1和MMP-3 mRNA表达随时间而降低,MMP-9、TIMP-1、Collagen Iα1 mRNA则随时间而增加;IL-1β与机械牵张联合作用使MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表达水平上调,TIMP-1和Collagen Iα1 mRNA表达下调,且具有时间依赖。单独机械牵张使Collagen Iα1 mRNA表达下降,IL-1β与机械牵张联合作用使其表达进一步下调,且具有时间依赖性。结论机械牵张与炎性因子联合作用可加剧角膜组织破坏,促进角膜膨隆的发生发展。

来源于全飞秒激光小切口微透镜摘除术的基质层人角膜成纤维细胞的原代培养与鉴定

目的评价体外培养与鉴定行全飞秒激光小切口微透镜摘除术(small incision lenticule extraction,SMILE)的近视患者角膜基质层来源的人角膜成纤维细胞的可行性。方法 8例16眼行SMILE的近视患者的角膜基质层组织分别进行组织块培养,采用细胞形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定。结果 8例SMILE来源的基质层人角膜成纤维细胞全部原代培养成功并稳定传代,细胞呈长梭形或三角形;免疫细胞化学鉴定:波形蛋白染色阳性,而角蛋白、结蛋白、S-100染色均为阴性。结论 SMILE来源的近视患者的角膜基质层是人角膜成纤维细胞培养的方便的组织来源。

TGF-β_1诱导体外培养角膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)对体外培养的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的诱导表达作用。方法体外培养的角膜成纤维细胞分实验组和对照组,对照组弃原培养液,加无血清培养液继续培养,实验组用不同浓度的TGFβ1(0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1)处理24h,用RTPCR方法检测角膜成纤维细胞CTGFmRNA的表达情况。结果1μg·L-1和10μg·L-1TGFβ1处理组CTGF/GAPDH像素比值分别为0.35±0.05和1.25±0.10,均较对照组高(0.13±0.02),差异具有统计学意义,同时CTGF/GAPDH比值随TGFβ1浓度增加而增加。结论TGFβ1可以诱导角膜成纤维细胞CTGF的表达,在角膜成纤维细胞中CTGF也可能是TGFβ1对细胞起作用的下游信号分子。

机械拉伸对兔角膜成纤维细胞增殖和迁移的影响

对兔角膜成纤维细胞施加5%应变、0.1Hz的周期性机械拉伸,采用流式细胞仪检测细胞增殖情况,划痕法研究细胞迁移情况。结果发现,与静态对照组相比,5%机械拉伸能够使S期细胞数量明显增多;施加1ng/mL表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)或100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)后细胞相对划痕宽度明显变小。与各自静态对照组相比,拉伸10h,单轴拉伸组相对划痕宽度明显增加,等双轴拉伸则无显著性差异;拉伸20h,无论是等双轴还是单轴拉伸,相对划痕宽度均明显增加;拉伸同时施加bFGF或EGF后相对划痕宽度均减小,与静态对照组相当。提示机械拉伸能够促进角膜成纤维细胞增殖,但抑制了细胞迁移行为,该抑制效应与拉伸作用方式有关;而bFGF和EGF则可以减弱牵拉引起的细胞迁移抑制效应。

周期性机械拉伸对兔角膜成纤维细胞MMP-2/TIMP-2及TGF-β1表达的影响

研究了周期性机械拉伸对角膜成纤维细胞外基质中金属蛋白酶-2(Matrix metalloprotei-nase-2,MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制剂-2(Tissue inhibitors of metalloproteinase-2,TIMP-2)及转化生长因子-β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)表达的影响。对正常兔角膜成纤维细胞进行幅度分别为5%、10%及15%的周期性机械拉伸,并分别于拉伸后6h、24h取细胞培养液,采用ELISA方法检测MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量。当拉伸幅度为5%时,6h、24h后,MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量与静态对照组相比均无统计学差异;当拉伸幅度为10%时,6h后MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量与静态对照组相比无统计学差异,24h后MMP-2的含量显著升高(p<0.05);当拉伸幅度为15%时,6h后MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量与静态对照组相比仍无统计学差异,拉伸24h后MMP-2、TGF-β1含量显著升高,TIMP-2含量显著降低(p<0.05)。结果表明,在体外以一定的幅度周期性拉伸角膜成纤维细胞一定时间后,细胞分泌的MMP-2、TIMP-2及TGF-β1发生显著改变,三者相互作用,共同调节角膜成纤维细胞的生物学行为。

结缔组织生长因子对角膜成纤维细胞α_5β_1整合素表达的影响

目的 :观察结缔组织生长因子 (connectivetissuegrowthfactor,CTGF)对体外培养的角膜成纤维细胞α5β1整合素表达的影响。方法 :体外培养兔角膜成纤维细胞 ,经 0 .5、5、5 0和 5 0 0ng/mlCTGF处理 2 4h后 ,用免疫组化染色检测角膜成纤维细胞α5β1整合素的表达情况。结果 :与对照组相比 ,0 .5、5、5 0和 5 0 0ng/ml的CTGF能呈剂量依赖性地促进角膜成纤维细胞α5β1整合素的表达 (P <0 .0 1)。结论 :一定浓度的CTGF能促进角膜成纤维细胞α5β1整合素的表达 ,它可能参与角膜基质损伤修复过程中角膜成纤维细胞与细胞外基质以及角膜成纤维细胞之间的黏附和角膜成纤维细胞的移行过程。

苦参碱对人角膜成纤维细胞细胞周期和凋亡的影响

目的观察苦参碱对体外培养的人角膜成纤维细胞周期和凋亡的影响。方法将分离培养的人角膜成纤维细胞(HCFs)纯化后,用不同浓度的Mat干预培养的HCFs的生长,并以0.1%地塞米松作为对照,在干预48 h后用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡。结果 Mat在80 mg/L以下的药物浓度处理HCFs 48 h后,未引起其明显的凋亡率的改变,并能使其细胞周期阻滞于G2/M期。而160 mg/L以上的药物浓度处理HCFs 48 h后,引起明显的细胞凋亡。结论 Mat在80 mg/L以下的浓度范围内,既能阻滞HCFs的细胞周期,又不增加其凋亡的发生率。

纤维蛋白粘合剂与人角膜成纤维细胞的生物相容性

目的探讨纤维蛋白粘合剂(FS)与全飞秒激光小切口透镜取出术(SMILE)来源的人角膜成纤维细胞(HCFs)的生物相容性。方法人角膜组织取自2018年3—4月于广西医科大学第一附属医院行SMILE患者12例24眼术中取出的角膜基质透镜,体外分离培养HCFs,观察HCFs在FS表面的生长状态。将HCFs分为2倍浸提液组和正常对照组,分别与2倍浸提液和完全培养基共培养,采用吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双染色法观察并比较各组细胞凋亡情况。将HCFs分为3个组,2倍浸提液组和正常对照组细胞每孔分别加入2倍浸提液和完全培养基各100μl,空白对照组无细胞,每孔加入100μl完全培养基,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测并比较3个组HCFs的细胞增生能力,并进行细胞毒性分级。将HCFs分为1倍浸提液组、2倍浸提液组和正常对照组,分别用1倍浸提液、2倍浸提液和完全培养基培养,采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测并比较3个组细胞凋亡率。结果HCFs在FS表面生长良好,形态正常。MTT法检测结果显示,2倍浸提液组与正常对照组的HCFs具有相似的增生趋势,2倍浸提液组HCFs的0~72 h毒性评级为0~1级。AO/EB染色结果显示,2倍浸提液组和正常对照组的HCFs状态均正常,仅可见极少量早期凋亡细胞。流式细胞术检测结果显示,正常对照组、1倍浸提液组和2倍浸提液组的细胞凋亡率分别为(4.96±1.09)%、(3.66±1.35)%和(2.88±0.66)%,差异无统计学意义(F=2.89,P=0.13)。结论FS无体外细胞毒性,与HCFs有良好的生物相容性。

IL-8对角膜成纤维细胞胶原合成的影响

促炎因子IL-8在圆锥角膜患者泪液中表达较高,但其作用机制尚不明确。胶原合成和降解异常是圆锥角膜的发病机制之一。通过探讨IL-8对正常角膜成纤维细胞胶原蛋白合成的影响及其分子机制,为进一步揭示圆锥角膜的发病机制提供参考。构建siRNA干扰体系,通过siRNA技术沉默角膜成纤维细胞中IL-8的表达;采用实时荧光定量PCR分析沉默IL-8后,促炎因子以及胶原合成和降解相关基因的表达变化;采用ELISA法检测总胶原的含量;采用明胶酶谱法检测MMP-2的活性;采用Western blot法检测沉默IL-8后相关信号途径关键蛋白的变化。结果发现:沉默IL-8表达后,角膜成纤维细胞总胶原含量及胶原合成基因(COL1A2,COL3A1,COL5A3,COL6A1)的表达显著升高,而胶原降解酶MMP-2的表达和活性下降;此外,沉默IL-8能够降低IL-6、IL-1β、VEGFA/VEGFR2基因和下游AKT、ERK1/2蛋白的表达。结果表明,IL-8调节角膜成纤维细胞中其他促炎因子及VEGF的表达,并通过PI3K/AKT、ERK信号通路负调控角膜成纤维细胞中胶原的合成,参与MMP-2介导的胶原降解过程。

机械牵拉对角膜成纤维细胞氧化应激、炎性因子和MMP-9表达的影响

探讨机械牵拉对人角膜成纤维细胞氧化应激水平、抗氧化能力、炎性因子及基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响。对体外培养的正常人(NC)及圆锥角膜患者(KC)角膜成纤维细胞进行周期性机械牵拉(幅度15%,频率0.1 Hz,时间12 h).采用荧光染色法检测活性氧自由基(ROS)水平;采用实时荧光定量PCR检测抗氧化酶基因表达;采用酶联免疫吸附试验方法检测炎性因子和MMP-9表达。结果发现:静态培养条件下, KC细胞ROS水平、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MMP-9均明显高于NC细胞;与静态培养组比较,机械牵拉显著增加了NC和KC细胞ROS、炎性因子和MMP-9蛋白表达水平;并使NC细胞部分抗氧化酶基因表达上调,但不同KC患者细胞牵拉后抗氧化酶表达不同。结果提示力学刺激可能通过处于较高氧化应激状态的圆锥角膜成纤维细胞释放更多的炎性因子,进而上调MMPs的表达,加速角膜细胞外基质降解,促进圆锥角膜的发生与发展。

机械性压力刺激对人角膜成纤维细胞形态和功能的影响

目的探究揉眼所致机械性压力刺激对人角膜成纤维细胞形态、增殖、凋亡及细胞外基质合成和降解的影响。方法从10例行SMILE手术患者的角膜基质透镜中分离培养角膜成纤维细胞。建立体外细胞机械性压力刺激系统,对角膜成纤维细胞施加0~524Pa的压力刺激。采用F-actin、BrdU、AnnexinV/P染色和qPCR检测压力刺激后人角膜成纤维细胞的形态学。

肿瘤坏死因子对圆锥角膜成纤维细胞基质金属蛋白酶及其抑制剂表达的影响

本文主要研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对圆锥角膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)表达的影响。利用酶消化法提取正常角膜和圆锥角膜成纤维细胞并对其施加不同浓度的TNF-α作用,通过蛋白质印迹法和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应分别检测细胞上清夜中MMPs蛋白和细胞中TIMPs基因的表达。结果发现圆锥角膜成纤维细胞上清液中存在MMP1的活性形式,且TNF-α能使之表达上调;TNF-α能促进圆锥角膜成纤维细胞MMP2、MMP3、MMP9表达,但使其TIMP1、TIMP2表达降低。TNF-α可能通过调节MMPs和TIMPs的表达在圆锥角膜的发生发展中起着重要的作用。

机械牵拉与前列腺素E_2联合作用下调圆锥角膜成纤维细胞赖氨酰氧化酶家族基因表达

为了研究机械牵拉与前列腺素E_2(PGE_2)对赖氨酰氧化酶(LOXs)家族基因表达的影响,本文对体外培养的正常人及圆锥角膜患者角膜成纤维细胞给予PGE_2处理,并进行幅度为12%、频率为0.1 Hz的周期性机械牵拉12 h,采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测LOXs家族基因的表达情况。研究结果显示,圆锥角膜患者的角膜成纤维细胞LOXs家族基因表达量普遍低于正常角膜;与静态培养组比较,单独机械牵拉使正常组的赖氨酰氧化酶样蛋白(LOXL)中的LOXL-2和LOXL-4基因表达上调,并使得圆锥角膜组的LOXL-3和LOXL-4基因表达下调;机械牵拉与PGE_2联合作用则使正常组的LOXL-4以及圆锥角膜组除LOXL-1之外的所有LOXs基因表达均下调。根据以上研究结果可提示,以机械牵拉和PGE_2同时作用,将下调圆锥角膜患者角膜成纤维细胞的LOXs家族基因表达,这将可能导致角膜胶原交联受阻,使胶原纤维之间的黏附力下降,胶原板层之间产生相对滑动,影响角膜结构稳定性,促进角膜发生圆锥膨隆。本文通过探讨研究力学刺激与炎性因子对LOXs家族基因表达的影响,有助于更好地理解圆锥角膜发生发展的可能机理,为圆锥角膜预防及治疗提供参考。

多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增生的影响

背景 多西环素是一种金属离子螯合剂和广谱抗生素,常用于眼表疾病的治疗. 目的 研究多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增生的影响,并探讨其作用机制.方法 收集6只新鲜牛角膜,分别用基础培养液配制的1.0g/L及2.0 g/L Ⅰ型胶原酶对牛角膜基质层进行二步法消化分离,制成细胞悬液后转入培养瓶中用RPMI-1640培养液（含质量分数10％胎牛血清）进行培养.取生长良好的细胞进行波形蛋白免疫细胞化学染色以确定所培养的细胞来自角膜基质层,在细胞传代培养的同时进行α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光细胞化学染色,呈阳性表现的细胞为角膜肌成纤维细胞.细胞培养36 h后培养液中不加入任何药物者为阴性对照组,阳性对照组细胞培养液中加入120 mg/L地塞米松,另分别在培养液中加入10、20、40、60、80 mg/L多西环素作为药物干预组.采用MTT比色法、流式细胞术测定各组干预24 h和48 h后角膜肌成纤维细胞的增生情况及细胞周期各时相的分布. 结果 体外分离培养的牛角膜肌成纤维细胞生长良好,免疫组织化学染色显示波形蛋白和α-SMA呈阳性反应,证实为角膜肌成纤维细胞.MTT比色法检测显示,随着多西环素质量浓度的增加,活性角膜肌成纤维细胞的数量逐渐下降,差异有统计学意义（F质量浓度=1233.778,P＜0.001）；随着药物作用时间的延长,活性角膜肌成纤维细胞的数量逐渐下降,差异有统计学意义（F时间=227.564,P＜0.001）；且两因素间的交互效应亦有统计学意义（F交互作用=51.656,P＜0.001）.流式细胞术细胞周期分析显示,10、20、40、60、80 mg/L多西环素作用24 h,G0-G1期角膜肌成纤维细胞率分别为82.85％、84.36％、85.18％、87.12％、89.31％,明显高于阴性对照组的63.89％,差异均有统计学意义（P＜0.05）,40 mg/L多西环素组G0-G1期角膜肌成纤维细胞率接近阳性对照组；10、20、40、60、80 mg/L多西环素作用48 h,G0-G1期角膜肌成纤维细胞率分别为82.78％、86.15％、88.23％、89.57％、93.00％,明显高于阴性对照组的70.17％,差异均有统计学意义（P＜0.01）,而40 mg/L多西环素组G0-G1期角膜肌成纤维细胞百分数接近阳性对照组.结论 在10 ～ 80 mg/L质量浓度时,多西环素以剂量-时间效应依赖的方式抑制体外培养牛角膜肌成纤维细胞的增生,40 mg/L多西环素与120 mg/L地塞米松具有相当的作用效果.

机械拉伸介导AQP1表达在角膜细胞外基质重塑中的作用机制研究

目的细胞外基质成分异常可导致角膜完整性丧失,结构破坏,生物力学性能降低,进而导致圆锥角膜。氧化应激在圆锥角膜的发病过程中发挥重要的作用。力刺激能够提高角膜氧化应激水平,参与圆锥角膜的发生,但其机制尚不明确。在细胞水平揭示机械拉伸介导的氧化应激调节细胞外基质代谢的分子机制。方法利用生物信息学方法对机械拉伸处理后角膜成纤维细胞基因表达谱进行分析,筛选响应机械拉伸的核心基因;通过siRNA技术降低角膜成纤维细胞中靶基因的表达。

多西环素对角膜瘢痕形成的影响

目的:研究多西环素对角膜瘢痕形成的影响。方法:(1)体外实验:收集人眼角膜基质分离并培养,使用免疫荧光双染鉴定所提取到的细胞为人角膜细胞。多西环素组在传代培养后加入重组人转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人角膜细胞分化成角膜肌成纤维细胞,培养2 h后加入浓度为20 ng/mL的多西环素溶液,另设不加入任何药物的对照组和只加入TGF-β1的模型组,放入培养箱继续培养48 h。蛋白免疫印迹(Western blotting)检测CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测CollagenⅠ和Fibronectin mRNA相对表达量。(2)体内实验:采用36只雌性SD大鼠构建角膜碱烧伤模型,随机分为对照组和多西环素组,每组18只。采用体视显微镜观察大鼠角膜恢复情况并在第3、第7、第14天进行角膜混浊度评分,角膜取材后做HE染色观察大鼠角膜组织结构变化。结果:模型组细胞Fibronectin、CollagenⅠmRNA和蛋白相对表达量均较对照组升高(均P<0.05),多西环素组细胞Fibronectin、CollagenⅠmRNA和蛋白相对表达量均较模型组降低(均P<0.05)。与对照组相比,大鼠角膜碱烧伤后第7、第14天,多西环素组大鼠角膜混浊度评分更低(P<0.05);HE染色图片,各个时间点多西环素组大鼠角膜基质结构更规整,第7天多西环素组上皮修复更佳、炎症细胞浸润更少。结论:多西环素可以抑制人角膜细胞分化为肌成纤维细胞,促进大鼠角膜碱烧伤后角膜愈合,减轻角膜瘢痕。