ResolvinE1对高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用

背景 以往防治角膜移植术后排斥反应的药物存在诱发局部或全身不良反应的风险，研究表明resolvinE1（RvE1）能够调节辅助性T细胞1（Th1）型免疫反应，但其对高危角膜移植术后的植片排斥反应有无抑制作用尚不清楚。目的观察高危角膜移植动物模型局部应用RvE1对植片免疫排斥反应的抑制作用。方法 以BALB/c小鼠为受体、C57BL/6小鼠为供体行角膜移植术。采用随机数字表法将90只BALB/c小鼠随机分成异体角膜移植组、异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组，每组各30只。BALB/c小鼠右眼先用缝线法刺激2周以建立高危角膜移植眼模型，然后行穿透角膜移植术。异体角膜移植组和异体角膜移植＋RvE1组小鼠右眼行异体角膜移植，自体角膜移植组小鼠将右眼角膜植片旋转180°后缝合于植床上。异体角膜移植组及自体角膜移植组小鼠术后每日用生理盐水10 μl结膜下注射1次，异体角膜移植＋RvE1组小鼠术后同法注射终质量浓度为0.1 μg/μl的RvE1 10 μl，连续7 d。术后裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜植片反应并对其排斥反应进行评分。术后21 d处死各组小鼠各20只，收集小鼠术眼角膜、眼球和术眼侧颈部淋巴结，采用苏木精－伊红染色法观察各组小鼠角膜植片的组织病理学变化；采用免疫组织化学法检测术眼角膜中CD4及γ干扰素（IFN-γ）的表达；采用流式细胞术检测术眼侧颈部淋巴结淋巴细胞中Th1细胞（CD3＋CD8a－IFN-γ＋）比例；采用荧光定量PCR法检测Th1细胞相关因子白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达水平。结果 异体角膜移植＋RvE1组小鼠角膜植片存活时间为（28.5±1.7）d，明显长于异体角膜移植组的（14.0±1.6）d，差异有统计学意义（t＝4.14，P〈0.001），自体角膜移植组小鼠植片在术后50 d存活率为100%。苏木精－伊红染色显示，异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组小鼠角膜植片水肿及炎性细胞浸润程度均轻于异体角膜移植组。免疫组织化学法检测显示，各组角膜全层均有CD4表达，而IFN-γ主要表达于角膜上皮层，异体角膜移植组小鼠角膜组织中CD4和IFN-γ阳性细胞数均明显多于异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组。流式细胞术检测显示，异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组小鼠淋巴细胞中Th1细胞比例分别为（1.07±0.25）%和（0.85±0.12）%，明显低于异体角膜移植组的（1.56±0.20）%，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。荧光定量PCR检测显示，异体角膜移植组小鼠角膜中IL-2、TNF-α、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达量明显高于异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论 RvE1可抑制小鼠高危角膜移植排斥反应，作用机制可能与其下调角膜植片和淋巴细胞中Th1细胞及相关细胞因子的表达有关。

高表达吲哚胺2,3-二氧化酶的树突状细胞对角膜植片存活时间的影响

目的研究高表达吲哚胺2,3-二氧化酶(in-doleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的树突状细胞(dendritic cells,DC)对角膜植片存活时间的影响。方法采用脂质体转染的方法将质粒CTLA4Ig转入F344大鼠(供体)DC,用荧光显微镜观察目的基因的表达,采用RT-PCR方法检测转染前后DC中IDO mRNA的表达变化,应用流式细胞仪检测转染前后不同时间的DC对同种异体T细胞的影响。以F344大鼠为供体、Lewis大鼠为受体建立大鼠同种异体角膜移植模型,将基因修饰后高表达IDO的DC在术后立即注入Lewis大鼠体内(实验组),注射转染前DC的受体为对照组。用裂隙灯观察角膜植片的存活情况,术后第7天用八肽胆囊收缩素测定受体鼠T淋巴细胞对供体抗原的反应。结果转染CTLA4Ig促进了树突状细胞IDO的表达(P<0.05),并且转染后48h的DC能显著引起T细胞凋亡(P<0.05),注射高表达IDO的DC能明显延长角膜植片的存活时间(P<0.01),治疗组Lewis大鼠T淋巴细胞对供体的抗原刺激的反应明显低于对照组(P<0.05)。结论高表达IDO的供体DC能特异性抑制受体对供体抗原的免疫反应,明显延长角膜植片存活时间。

经不同途径注射的绿色荧光蛋白基因在大鼠颌下淋巴结的表达

目的研究阳离子聚合物梭华-Sofast基因转染试剂(sofast gene transferreagent,Sofast)介导的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene,PEGFP-N2)经不同途径注射后在大鼠颌下淋巴结(submandibular lymph nodes,SMLN)的表达情况,并寻求将外源基因转染到颌下淋巴结的最佳途径。方法经右眼前房、结膜下、颞下方穹隆部和下睑皮下给大鼠注射Sofast基因转染试剂和PEGFP-N2的复合物Sofast/DNA,通过荧光显微镜检查和流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测各组大鼠同侧的颌下淋巴结PEGFP-N2基因的表达分布和表达量。结果注射Sofast/DNA复合物48h后,前房注射组、结膜下注射组、颞下方穹隆部注射组和下睑皮下注射组的同侧颌下淋巴结均可检测到荧光表达。颞下方穹隆部注射组[(12.86±1.59)%]和下睑皮下注射组[(13.83±2.61)%]的流式细胞仪检测的阳性表达细胞的百分比高于结膜下注射组[(5.74±1.59)%]和前房注射组[(6.53±1.56)%](P<0.01)。结论经Sofast介导的PEGFP-N2在大鼠颞下方穹隆部注射和下睑皮下注射后可以直接有效地在同侧颌下淋巴结表达。