角膜缘干细胞标志物

角膜缘干细胞是角膜上皮再生的源泉,属成体干细胞,有其独特的生物学特性。角膜缘干细胞标志物的确立,对于建立规范的角膜缘干细胞分离纯化和培养方法、进一步研究其生物学特性起着决定性的作用。通过查阅国内外文献资料,对角膜缘干细胞标志物的最新研究进展作一综述。

角膜缘干细胞标志物的研究进展

角膜缘干细胞(LSCs)通过不断地增殖分化维持着角膜上皮的完整性和内稳态,对保护角膜和维持角膜透明性起着重要的作用。角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)是目前角膜疾病致盲的主要原因之一,LSCs移植是治疗的热点。移植的有效性主要取决于LSCs占移植细胞总数的比例,因此明确识别LSCs至关重要。虽然LSCs标志物有很多,但它们的特异性备受争议,故LSCs移植的主要挑战之一是缺乏明确的细胞标记物。本文将对LSCs标志物的最新研究进展做一综述。

角膜缘干细胞标记物的研究进展

角膜缘干细胞（limbal stem cells．LSCs）是角膜上皮再生和修复的源泉．在眼表重建中起着极为重要的作用。当前．对LSCs的研究已深入至分子水平，在其发育生物学特性和特异性分子标记物寻找上有了新的进展。为促进LSCs基础研究的进一步开展，本文就其分子标记物的研究现状及面临的问题作一综述。

角膜缘干细胞标记物研究现状

当前视觉科学研究领域及眼科临床存在的主要难题包括:缺乏适当的移植材料治疗眼表疾病以及青光眼、视网膜黄斑疾病等的视功能保护和有效治疗等。随着干细胞和组织工程学研究的推广,越来越多的研究人员已经认识到干细胞标记物的重要性。角膜缘干细胞是角膜上皮的唯一细胞来源,对维持角膜上皮的动态稳定和角膜透明性具有极其重要的作用。而角膜缘干细胞标记物的确立对建立规范的角膜缘干细胞分离纯化和培养方法、进一步研究其生物学特性起着决定性的作用。本文就该研究领域现状及前景作一简要综述。

角膜缘干细胞的识别与分离研究进展

角膜缘干细胞（LSCs）是角膜上皮组织维持自我更新和损伤后修复的基础，对角膜的完整性和透明性至关重要。对LSCs的准确识别与分离有助于深入探讨LSCs的性质及用于治疗LSCs缺乏。目前发现的LSCs分子标志物的数量较多，但其特异性均存在差异，多种利用干细胞属性间接标记LSCs的方法有助于对LSCs的分离和识别。就近年来利用分子生物学标记、细胞形态及功能在识别LSCs方面的研究进展，以及纯化分离LSCs的新技术进行综述。

角膜缘干细胞识别的研究进展

角膜干细胞存在于角巩膜缘被人们所认识已有20年了[1]。随着对角膜缘干细胞研究的深入,发现其对角膜的完整性及功能至关重要。正常情况下角膜缘干细胞具有上皮屏障的作用,能阻止结膜上皮及血管向角膜内生长。角膜缘干细胞缺乏将导致各种眼表功能异常。角膜缘干细胞的定位和分离,对临床上应用角膜缘干细胞移植治疗各种眼表异常具有重要意义。就国内外对角膜缘干细胞识别的研究做一综述。

角膜缘干细胞研究新进展

位于角膜最外层的角膜上皮细胞,正常损耗或创伤后,由角膜缘干细胞不断自我更新补充。当损伤等致角膜缘干细胞缺乏时,则会导致角膜溃疡、新生血管、混浊等角膜病变而影响视力。目前治疗这些角膜疾病的重要方式之一为移植体外培养的角膜缘干细胞。本文将从角膜缘干细胞的定位、体外培养、新细胞来源等方面进行综述。

角膜缘干细胞移植的研究进展

角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells,LSCs)是角膜上皮再生的源泉,属成体干细胞,维持角膜完整性。对于以角膜缘干细胞缺陷为特征的眼表疾病,随着对LSCs生物学特性的了解,相继出现了羊膜移植、LSCs移植以及培养的LSCs移植的治疗手段。通过查阅国内外相关文献资料,对LSCs移植的研究进展作一综述。

自体骨髓间充质干细胞移植对兔角膜碱烧伤炎症反应的抑制作用

背景 眼表碱烧伤可引起角膜溃疡及角膜新生血管形成,导致角膜混浊,目前尚无有效的疗法.已有研究认为间充质干细胞（MSCs）移植具有修复角膜损伤的作用,但其在体内对角膜碱烧伤治疗的作用机制尚不清楚. 目的 研究兔自体骨髓间充质干细胞（BM SCs）对碱烧伤角膜的抗炎机制.方法 抽取2～3月龄日本大白兔骨髓,经体外分离培养得到BMSCs并进行传代,取第3代细胞用于实验,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,对细胞进行生物学鉴定.采用角膜贴敷NaOH滤纸法在24只日本大白兔的右眼建立中度角膜碱烧伤模型,然后将造模成功的实验兔应用随机数字表法随机分为2个组,于碱烧伤后1h分别在模型眼结膜下注射同种自体BMSCs悬液300μl（细胞密度5×106/μ1）（BMSCs组）或等容积PBS（PBS组）,每组各12只.分别于移植后3、14和28 d于裂隙灯显微镜下观察角膜的混浊度变化并进行评分,采用组织病理学方法检查角膜组织中炎症反应程度并进行多形核中性粒细胞（PMNs）计数;采用免疫组织化学染色法定位并检测角膜组织中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达.结果 体外分离培养的兔BMSCs贴壁生长,呈长梭形,细胞形态均一,传代后其形态无明显改变.细胞表面黏附分子标志物CD29和CD90阳性表达的细胞比例分别为99.18％和97.94％,而造血细胞标志物CD34和CD31的阳性表达分别为0.74％和0.15％.造模后兔右眼出现角膜混浊、上皮脱落、角膜基质水肿和新生血管形成,移植后14d和28 d BMSCs组混浊度评分分别为2.37±0.52和2.25±0.50,均明显低于PBS组的3.00±0.53和3.25±0.50,差异均有统计学意义（t=2.376、2.828,均P＜0.05）;移植后14 d和28 d BMSCs组角膜中PMNs数目分别为（34.17±1.85）/12个视野和（25.64±3.86）/12个视野,明显少于PBS组的（42.70±1.54）/12个视野和（32.67±1.42）/12个视野,差异均有统计学意义（t=10.021、4.832,均P=0.000）;移植后14 d和28 d BMSCs组角膜组织中MMP-2蛋白的阳性表达量（A值）分别为0.388±0.016和0.384±0.006,明显低于PBS组的0.438±0.006和0.412±0.005,差异均有统计学意义（t=10.205、13.514,均P=0.000）.结论 角膜碱烧伤后早期行自体BMSCs移植可减少PMNs浸润,减轻角膜的炎症反应,下调或抑制MMP-2在受损角膜处的表达,抑制基质胶原纤维的降解,从而减少碱烧伤后角膜溃疡的发生。

治疗性角膜移植联合羊膜移植及千细胞移植的手术配合

多年来，眼烧伤后角膜穿孔的治疗一直是眼科界的难题。这类角膜穿孔预后极差，往往导致眼内容物脱出、眼内炎等严重的眼内并发症而摘除眼球，单纯的穿透性角膜移植术或板层角膜移植术可以封闭角膜穿孔，但由于不能长时间维持角膜上皮完整，会导致角膜结膜化、疤痕化或角膜基质再次溶解穿孔，预后不佳，临床研究证实自体角膜缘干细胞移植是进行眼表面重建最有效的方法。现将治疗性角膜移植联合羊膜移植及干细胞移植的手术配合介绍如下。

核质双向转运受体蛋白importin13在角膜缘肿瘤中的差异性表达及其意义

背景正常干细胞相关标志物的发现为肿瘤发生机制的研究及寻找特异性的肿瘤干细胞标志物提供了新的思路，importinl3（IPO13）是新发现的IPOB家族的成员，是该家族中惟一具有细胞核和细胞质双向转运功能的蛋白，其在眼部及角膜缘肿瘤组织中生物学特性的研究甚少。目的研究细胞核及细胞质双向转运受体蛋白IPO13在人角膜缘肿瘤中的表达，并与角膜缘干细胞标志物p63的表达进行比较，探讨两者在人角膜缘肿瘤中的表达差异及意义。方法收集正常人供体眼球角膜缘处的结膜及角膜缘组织、角膜结膜乳头状瘤（CCP）和角膜结膜上皮内上皮癌（CCIN）组织标本各6例，采用冰冻切片免疫组织化学染色法检测相应组织中IPO13、p63的表达量（A值）。采用单因素方差分析法和SNK—q检验进行统计学比较。结果IPO13主要表达于人正常眼球结膜、角膜缘上皮基底细胞的细胞核内，表达于CCP、CCIN组织上皮基底细胞和基底上层细胞的细胞核内，呈棕褐色颗粒。IPO13蛋白在正常角膜结膜、CCP、CCIN组织中的表达量（A值）分别为1687±1014、3546±1375和7635±2854，总体差异有统计学意义（F=7．23，P〈O．05），其中CCP、CCIN组织中的表达量明显高于正常角膜结膜组织，差异均有统计学意义（q=4．02、5．13，P〈0．05）；CCIN组织中的表达量明显高于CCP组织，差异有统计学意义（q=3．45，P〈O．05）。p63在正常人眼球结膜、角膜缘、CCP组织上皮基底细胞和基底上层细胞的细胞核内及CCIN组织上皮全层的细胞核内均有表达。p63在正常角膜结膜组织中、CCP、CCIN组织中的表达量分别为2110±1229、3966±2129和6650±2136，差异有统计学意义（F=6．17，P〈0．05），其中CCP、CCIN标本中阳性表达的A值均明显高于正常角膜结膜标本（q=4．33、5．01，P〈0．05），CCIN标本中阳性表达的A值明显高于CCP标本，差异有统计学意义（q=3．83，P〈0．05）。结论IPO13在角膜缘上皮增生性病变中的低分化细胞中作为标志物较p63更具特异性。与正常角膜结膜组织相比，IPO13与p63在CCP、CCIN组织中的表达逐步上调，可能在角膜结膜增生性病变中起到正性调控作用。IPO13与p63在良性与恶性角膜缘上皮增生性病变中的表达差异明显，提示IPO13与p63可能在角膜缘上皮增生性病变的异常增生与分化中起重要的调控作用。

温度敏感性材料培养的脂肪源性干细胞作为眼表重建种子细胞的可行性研究

背景 组织工程角膜学的发展为角膜盲的治疗提供了新的选择,但目前暂未发现培养方法简单、可行性好的角膜上皮种子细胞和理想的支架材料.研究表明,脂肪源性干细胞（ADSCs）具有自我更新能力同时也具有类上皮的特质,而温度敏感性材料（TRSs）作为支架进行干细胞培养也为细胞层片技术的进步提供了技术支撑. 目的 研究兔ADSCs在TRSs上的培养特性,并与经典的口腔黏膜上皮细胞（OMECs）特性进行比较,探讨ADSCs作为眼表重建种子细胞的可行性.方法 异丙基丙烯酰胺溶于二丙醇后均匀涂于直径35 mm的聚苯乙烯培养皿表面,利用电子束照射制备TRSs,兔颈背部皮下脂肪组织2～3g经消化培养后获得ADSCs,同时取出兔口腔黏膜组织进行消化培养,获得OMECs.将2种干细胞均接种于TRSs上继续培养,比较2种细胞形态、生长速度、脱附时间和成活细胞的总计数,将ADSCs层片和OMECs层片行组织病理学检查,观察2种细胞的形态特征;采用免疫组织化学法检测2种细胞中干细胞标志物和上皮细胞标志物的表达;应用扫描电子显微镜检查2种细胞层片的表面超微结构.结果 自制TRSs透明性和光滑度与普通培养皿接近,任意观察的5个样品中有4个水接触角＞10°,成功率为80％.TRSs上培养的ADSCs呈长梭形,OMECs呈不规则圆形.ADSCs生长周期在TRSs上为12～ 14 d,脱附时间为（46.0±9.6） min,细胞总计数为（7.9±1.1）×105/片,而TRSs培养的OMECs生长周期为14～16 d,脱附时间为（91.9±10.9） min,细胞计数为（45.8±26.5） ×105/片,2种细胞间层片脱附时间和细胞计数的差异均有统计学意义（P=0.002、0.028）.组织病理学检查显示,TRSs上的ADSCs呈1～3层排列,而OMECs呈4～5层覆层结构.免疫组织化学染色显示,ADSCs和OMECs细胞层片细胞角蛋白12（CK12）及干细胞标志物p63、ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）均呈阳性表达.扫描电子显微镜下观察可见ADSCs和OMECs表面均有致密的上皮微绒毛结构,细胞间连接紧密.结论 自制的TRSs可作为脂肪干细胞的培养支架,ADSCs取材广泛,TRSs上培养的ADSCs层片细胞活力好,可操作性强,可作为眼表重建新的种子来源。

角膜缘干细胞的鉴定、筛选与培养的研究进展

角膜缘干细胞(Li mbal epithelial stemcell,LESC)对于研究角膜上皮和重建眼表均有非常重要的意义。而如何鉴定、筛选以及筛选后如何培养扩增LESC仍是目前困扰干细胞研究的瓶颈。以往对LESC的定位仍集中于寻找相关标志物如P63、ABCG2、整合素等;而分离纯化干细胞的方法也有多种,如流式细胞仪筛选法、快速吸附法、细胞大小筛选法等;体外培养扩增干细胞亦集中于拟造一个干细胞niche环境即干细胞龛培养扩增LESC。本文对目前LESC一些热点标志物、分离方法以及体外拟造niche环境的研究做一综述。

角膜缘干细胞研究现状及展望

角膜缘干细胞的发现是眼科领域的重要进展,角膜缘干细胞移植治疗严重眼表疾病已取得初步效果。但有关角膜缘干细胞的鉴定、分离、体外培养和转归等仍是制约这一领域深入发展的瓶颈,加强对角膜缘干细胞的基础研究对角膜盲的防治有重要意义。

超大翼状胬肉行手术切除联合角膜缘干细胞移植术一例

患者男性，72岁。因左眼鼻侧眼白长膜状物20年，伴视物不清5年就诊。视力：右眼0．12（＋0．75／＋1．75x60=0．4），左眼HM／30cm（矫正无提高）。

《自然》:标记、修复及培养角膜缘干细胞或有新方法

英国《自然》杂志上，美国科学家发表的最新研究指明了一种生物标记物。其能够用来分离进而修复受损眼睛的干细胞。这些干细胞位于角膜和眼白交界处的角膜缘上。与此同时，另一篇发表在《自然》杂志上的论文。描述了一种培养角膜缘干细胞的方法。这些研究结果都将有助于改善角膜疾病的治疗。

双眼翼状胬肉切除术后诱发蚕蚀性角膜溃疡1例

患者男性,67岁。因双眼鼻侧结膜新生物长入角膜,于当地医院行双眼翼状胬肉切除＋角膜缘干细胞移植术,术后3年,双眼出现眼红、眼痛、视物不清,2012年3月30日于我院就诊,诊断为：（1）双眼蚕蚀性角膜溃疡,（2）双眼翼状胬肉切除术后,（3）双眼年龄相关性白内障。

兔角膜缘上皮细胞端粒酶表达的实验研究

目的 探讨将角膜上皮各区域表层和基底层细胞端粒酶作为角膜缘干细胞标志物的可能性。方法 采用端粒重复序列扩增(TRAP)方法分别对8只新西兰大白兔(8只眼)角膜缘和中央透明角膜上皮细胞端粒酶活性进行定性分析,并利用生物发光技术对角膜缘和中央透明角膜上皮细胞端粒酶活性进行定量分析。其中4只兔(4只眼)结膜下注射5氟尿嘧啶(5 Fu)20mg, 4只兔(4只眼)未注射任何药物。结果 8只兔眼透明角膜上皮细胞平均生物发光值为34. 912,端粒酶表达均为阴性;角膜缘上皮细胞平均生物发光值为165. 575, 端粒酶表达均为阳性,二者比较差异有统计学意义(P=0 .001)。5 Fu注射组角膜缘上皮细胞平均生物发光值为185. 396, 未注射5 -Fu组角膜缘上皮细胞平均生物发光值为145 .754,二者比较差异有统计学意义(P=0. 02)。阳性对照组生物发光值为210 832,阴性对照组生物发光值为34 793。结论 角膜缘上皮细胞端粒酶表达阳性而透明角膜上皮细胞表达阴性,表明角膜缘存在具有极强增殖能力的干细胞,端粒酶可能成为角膜干细胞的标志物。

人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞及运动神经元生存蛋白表达的研究

目的 定向诱导人骨髓间质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞,并检测诱导前后细胞的运动神经元生存(SMN)基因mRNA及蛋白质的表达。方法 分离和纯化hMSC;在体外用碱性成纤维细胞生长子预诱导hMSC,再用二甲基亚砜和丁化羟基苯甲醚诱导hMSC分化为神经元样细胞;用免疫细胞化学方法鉴定诱导前后的细胞是否表达神经元特异性标志物神经元稀醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)以及SMN蛋白;用RT- PCR检测诱导前hMSC及诱导后神经元样细胞SMN基因mRNA的表达。结果 hMSC诱导3h后,大多数细胞转变为类似于神经元的形态,有长的突起,相互之间连接呈网状。NSE、NF进行鉴定,结果显示NSE、NF呈阳性。诱导前的hMSC及诱导后的神经元样细胞均可见SMN基因mRNA表达,但诱导后表达增加,差异有统计学意义(P<0 .01),且诱导后神经元样细胞SMN蛋白表达为阳性。结论 hMSC能分化为神经元样细胞,并表达神经元的特异性标志物。hMSC分化的神经元样细胞既能高表达SMN基因的mRNA,也表达SMN蛋白。