花背蟾蜍蝌蚪视神经再生与角膜诱导间关系的研究

以花背蟾蜍 (Buf o raddei Strauch)后肢芽期蝌蚪为材料 ,切断其左眼视神经并进行角膜移植 ,在角膜诱导的不同时期取眼球固定 ,用环氧树脂 Epon 812包埋 ,制成半薄切片 ,用次甲蓝、天青 、硼砂染色后 ,在光学显微镜下观察切断视神经后视网膜的退化过程及在视神经再生的情况下视网膜诱导皮肤移植片转化为角膜的作用 .结果表明 ,切断视神经 ,引起视网膜逐渐退化 ,移植的皮肤片与正常的皮肤基本相似 ;在分断的视神经发生再生并恢复其正常的生理功能的情况下 ,退化的视网膜逐渐恢复 ,同时被移植的皮肤片也出现表皮的去分化及表皮变薄等被诱导为角膜的过程 .

Ⅱ型胶原酶构建在体角膜扩张动物模型的可行性研究

背景 圆锥角膜以角膜中央或旁中央进行性变薄膨出、高度散光或角膜瘢痕为临床特征，其发病机制和防治是研究热点，但目前尚无公认的圆锥角膜动物模型建立方法。圆锥角膜的解剖病理基础是角膜扩张，探讨角膜扩张的圆锥角膜动物模型的建立方法有助于对圆锥角膜的角膜生物力学变化进行研究。 目的 应用可视化角膜生物力学分析仪（Corvis ST）检测Ⅱ型胶原酶处理后角膜的生物力学性能，探讨利用Ⅱ型胶原酶构建在体角膜扩张模型的可行性。 方法 选取健康新西兰白兔10只，刮除兔眼角膜上皮后，将直径为8 mm的角膜环钻置于右眼角膜中央，滴入5 mg/ml Ⅱ型胶原酶（含质量分数15%右旋糖酐的PBS配制）溶液，浸泡角膜30 min制备角膜扩张模型，左眼以同样方法用含15%右旋糖酐的PBS浸泡角膜30 min作为对照。于造模前及造模后14 d，采用手持电子角膜曲率计和手持角膜超声测厚仪分别测定角膜平均曲率（Km）及中央角膜厚度（CCT），造模后14 d采用Corvis ST行在体角膜生物力学参数测定，过量麻醉法处死实验兔并收集角膜组织行组织病理学及透射电子显微镜检查。 结果 造模前，模型组和对照组兔Km值分别为（48.28±2.29）D和（48.82±1.63）D，CCT分别为（356.50±19.13）μm和（356.20±21.66）μm，差异均无统计学意义（均P〉0.05）。造模后14 d，模型组兔眼Km增加至（48.87±2.27）D，CCT减少至（340.40±19.84）μm，与对照组的（46.86±1.47）D和（367.80±23.38）μm比较，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。造模后14 d，模型组兔角膜最大压陷深度平均值为（1.25±0.07）mm，明显大于对照组的（1.15±0.13）mm，差异有统计学意义（t＝2.65，P〈0.05），2个组间第1/第2压平时间、第1/第2压平角膜长度、第1/第2压平速度、最大压陷曲率半径和最大压陷时两屈膝峰间距的差异均无统计学意义（均P〉0.05）。角膜组织形态学和超微结构检查显示，与对照组比较，模型组兔角膜基质胶原纤维排列疏松、紊乱，纤维间隙增大。 结论 Ⅱ型胶原酶能降低角膜生物力学特性，可考虑用于建立动物角膜扩张模型。

小鼠角膜新生血管内皮细胞的分离培养及其趋化因子受体的表达

背景研究角膜新生血管生成的病理机制对角膜新生血管的治疗具有重要意义，但目前的相关研究多采用非角膜新生血管来源的血管内皮细胞，研究结果的可靠性受到一定影响。目的探索从碱烧伤诱导实验性小鼠角膜新生血管组织中分离和培养血管内皮细胞的方法，并检测新生血管内皮细胞中趋化因子受体的表达，为角膜新生血管内皮细胞的生物学特性研究奠定基础。方法7—8周龄SPF级健康雄性BALB／c小鼠10只，采用NaOH碱烧伤法构建小鼠实验性角膜新生血管模型，采用免疫荧光技术检测CD31在角膜新生血管中的表达。在碱烧伤后2周摘取眼球分离角膜组织，眼科手术剪剪碎角膜组织后应用胶原酶D消化获取单个细胞，使用包被CD31抗体的磁珠分选获取血管内皮细胞。采用免疫组织化学染色法检测CD31在细胞中的表达以鉴定培养的细胞，采用逆转录PCR法检测血管内皮细胞中趋化因子受体基因的表达。结果碱烧伤后7d裂隙灯显微镜下可见小鼠左眼角膜出现新生血管，碱烧伤后2周角膜新生血管的形成达高峰，免疫荧光检测可见角膜组织内特异性CD31染色的血管网。角膜新生血管血管内皮细胞培养后2h贴壁生长，形态呈扁平多边形，体积较大，传代培养后细胞生长速度明显加快。培养的角膜新生血管内皮细胞CD31表达阳性，细胞质中呈棕黄色染色，而角膜基质细胞中CD31表达阴性。逆转录PCR结果显示分离培养的血管内皮细胞中CCR1、CCR2、CCR3和CCR4mRNA相对表达量最高，CXCR3、CCR6、CCR10和CX3CRlmRNA呈中等强度表达，CCR5、CCR8mRNA相对表达量较低，而CCR9、CXCR4和CXCR5mRNA表达未检测到。结论CD31抗体的磁珠分选法可有效分离纯化小鼠角膜新生血管内皮细胞，并可进行体外培养且培养的细胞可表达趋化因子受体。