本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩...本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。展开更多
为了探索影响平原型和田羊羊毛品质的角蛋白关联蛋白(keratin association protein,KAP)4.2基因的结构与功能,试验以平原型和田羊毛囊总RNA反转录得到的cDNA为模板,经RT-PCR扩增KAP4.2基因成熟蛋白序列,与pMD18-T载体连接,经PCR扩增、...为了探索影响平原型和田羊羊毛品质的角蛋白关联蛋白(keratin association protein,KAP)4.2基因的结构与功能,试验以平原型和田羊毛囊总RNA反转录得到的cDNA为模板,经RT-PCR扩增KAP4.2基因成熟蛋白序列,与pMD18-T载体连接,经PCR扩增、双酶切鉴定连接正确后再与原核表达载体pET-28a连接,连接正确后对其测序并进行同源性分析及氨基酸分析。结果表明:平原型和田羊重组质粒pMD-18T-KAP4.2构建成功,表达质粒pET-28a-KAP4.2成功原核表达。在不同诱导时间KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,在诱导4小时时蛋白表达量最大;不同体积IPTG诱导后KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,体积为10μL时蛋白表达量最大。平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊(X05639.1)基因序列同源性为99.1%,显示有3处发生突变,分别为第77位的T突变为C,第108位的G突变为T,第200位的C突变为T。平原型和田羊KAP4.2蛋白基因第26位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸,第67位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。说明平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊基因序列同源性较高,虽然高度保守,但存在碱基突变和氨基的变异。展开更多
文摘本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。
文摘为了探索影响平原型和田羊羊毛品质的角蛋白关联蛋白(keratin association protein,KAP)4.2基因的结构与功能,试验以平原型和田羊毛囊总RNA反转录得到的cDNA为模板,经RT-PCR扩增KAP4.2基因成熟蛋白序列,与pMD18-T载体连接,经PCR扩增、双酶切鉴定连接正确后再与原核表达载体pET-28a连接,连接正确后对其测序并进行同源性分析及氨基酸分析。结果表明:平原型和田羊重组质粒pMD-18T-KAP4.2构建成功,表达质粒pET-28a-KAP4.2成功原核表达。在不同诱导时间KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,在诱导4小时时蛋白表达量最大;不同体积IPTG诱导后KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,体积为10μL时蛋白表达量最大。平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊(X05639.1)基因序列同源性为99.1%,显示有3处发生突变,分别为第77位的T突变为C,第108位的G突变为T,第200位的C突变为T。平原型和田羊KAP4.2蛋白基因第26位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸,第67位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。说明平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊基因序列同源性较高,虽然高度保守,但存在碱基突变和氨基的变异。
