辽宁绒山羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8.1基因表达研究

本试验通过Real-time PCR研究辽宁绒山羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白(KAP)8.1基因相对表达量,并与其他3个品种羊进行对比,从而明确角蛋白关联蛋白8.1基因对绒山羊皮肤毛囊发育及毛纤维品质的调控作用。结果表明,角蛋白关联蛋白8.1基因可在辽宁绒山羊皮肤毛囊内表达,相对表达量上调1.2倍。不同品种毛绒用羊角蛋白关联蛋白8.1基因m RNA相对表达量为:辽宁绒山羊>南非肉用美利奴羊(♂)×东北细毛羊(♀)(简称南×东)>南非肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)(简称南×寒)>东北细毛羊(♂)×小尾寒羊(♀)(简称东×寒)(毛纤维直径:东×寒>南×寒>南×东>辽宁绒山羊)。由此可见,毛纤维直径越细,角蛋白关联蛋白8.1基因m RNA相对表达量越高。说明角蛋白关联蛋白8.1基因可能对辽宁绒山羊毛纤维的细度具有一定的调控作用。

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.

不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1基因差异表达研究

试验旨在研究不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1(keratin associated protein 8-1,KAP8-1)基因相对表达量,从而明确KAP8-1基因对绵羊皮肤毛囊发育的调控作用。采用Real-time PCR SYBR GreenⅠ染料法,测定KAP8-1基因荧光定量Ct值,所得结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。结果表明,南非肉用美利奴羊(♂)×东北细毛羊(♀)组、南非肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)组、杜泊羊(♂)×小尾寒羊(♀)组3个品种羊皮肤毛囊内KAP8-1基因均有表达,且三者相对表达量的比值为7.56∶2.19∶1。说明KAP8-1基因对皮肤毛囊发育、羊毛品质差异均具有一定的调控作用,且品种之间存在一定的差异。

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。

角蛋白及其角蛋白关联蛋白(KAP)的研究介绍

本文综述了近年来角蛋白及其角蛋白关联蛋白(KAP)在羊及牦牛上的研究进展,重点介绍了KAP的研究进展,并简述了角蛋白及其角蛋白关联蛋白(KAP)的功能。

绒山羊角蛋白关联蛋白基因家族研究进展

羊绒是绒山羊的主要产品,其产量和品质直接关系到绒山羊产业的经济效益。角蛋白关联蛋白(KAP)作为羊绒纤维的主要结构蛋白之一,对绒毛的物理特性起着决定性作用。角蛋白关联蛋白基因家族(KRTAPs)编码KAPs,解析该基因家族成员的结构、功能及其表达调控对了解羊绒性状的形成、发育和遗传改良意义重大。该文综述了山羊KRTAPs基因的种类、染色体定位、核苷酸多态性与组织表达及其对羊绒性状的影响等方面相关研究进展,以期为后续研究提供参考。

羊毛蛋白质组学研究进展

羊毛是由蛋白质组成的天然纤维,被广泛应用于纺织等行业,然而随着经济的发展,人们对羊毛品质的要求越来越高,传统的研究方法已满足不了人们对羊毛蛋白研究的需要。蛋白质组学作为后基因组时代的一门新兴学科,可大规模、高通量、系统化地从整体水平研究羊毛蛋白质的组成、功能及其蛋白之间的相互作用,在羊毛研究领域已得到广泛应用。文章从羊毛蛋白质组学的研究方法,已知的羊毛蛋白质以及蛋白组学在羊毛蛋白质研究中的应用进展进行了综述,以期为蛋白质组学在羊毛中的应用提供参考。

内蒙古白绒山羊编码HGT-Ⅰ型蛋白的特征分析

对内蒙古白绒山羊毛囊兴盛期的表达序列标签(EST)进行生物信息学方法的分析,通过在Genbank核酸数据库的Blastn相似性检索后发现有22个ESTs与小鼠的HGTproteintypeIE5mRNA基因有很高的同源性,进一步地分析发现这22个ESTs可分为两种不同的序列。经ORF(开放读码框)的预测共编码2种不同的蛋白质。这2个蛋白质的氨基端和羧基端的氨基酸残基都十分得相似,其甘氨酸、酪氨酸的含量达到了71.93%,而苯丙氨酸的含量达到了10.18%。并对其进行了二级结构的预测,发现它们在二级结构上有着很高的相似性。这2个蛋白质家族成员与小鼠的HGT蛋白质在氨基酸的组成和结构上都有很高的保守性。

CK18、HGF血清水平变化与喉癌患者临床分期的关联性及动态监测临床意义

目的研究细胞角蛋白18(CK18)、肝细胞生长因子(HGF)血清水平变化与喉癌患者临床分期的关联性及动态监测意义。方法选取2018年7月至2019年7月鹤壁市人民医院喉癌患者89例,及同期声带息肉患者、健康体检者各60例,均检测其血清CK18、HGF水平。比较治疗前喉癌患者、声带息肉患者、健康体检者血清CK18、HGF水平及喉癌患者不同临床特征血清CK18、HGF水平,对比治疗后1 d、3 d、7 d生存、死亡患者血清CK18、HGF水平,并分析治疗后3 d血清CK18、HGF水平对死亡喉癌患者的预测价值。结果喉癌患者血清CK18、HGF水平高于声带息肉患者、健康体检者,且声带息肉患者高于健康体检者(P<0.05);中低分化程度、Ⅲ~Ⅳ临床分期、有淋巴结转移喉癌患者血清CK18、HGF水平较高(P<0.05);治疗后3 d、7 d死亡喉癌患者血清CK18、HGF水平高于生存患者,随着治疗时间延长,生存患者血清CK18、HGF水平逐渐降低,死亡患者血清CK18、HGF水平逐渐升高(P<0.05);经ROC曲线分析,CK18预测死亡喉癌患者AUC值为0.754,HGF预测AUC值为0.802。结论喉癌患者血清CK18、HGF水平表达异常,与临床分期、分化程度等病理学特征有相关性,临床可通过监测其动态变化预测预后,具有重要临床意义。

96例胸腺瘤患者MSCT检查征象及其与组织CKP、VEGF表达的关联性探究

目的探讨胸腺瘤患者多层螺旋CT(MSCT)检查征象及其与组织细胞角蛋白(CKP)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的关联性。方法选取河南省濮阳市人民医院收治的96例胸腺瘤患者及42例胸腺囊肿患者为研究对象,所有患者均行MSCT检查,总结其影像学特征,并检测其病理切片CKP、VEGF表达水平,分析MSCT影像学特征与CKP、VEGF表达相关性。结果胸腺瘤组织中CKP++~+++、VEGF++~+++表达率(78.13%、73.96%)显著高于胸腺囊肿组织(14.29%、11.90%),差异显著(P<0.05);胸腺瘤组织中VEGF表达与CT征象尖角征/锯齿征,分叶征,侵犯胸膜、心包、大血管存在相关性(P<0.05),与密度是否均匀、是否存在纵隔脂肪线无关(P>0.05);胸腺瘤组织中CKP表达与CT征象密度均匀,尖角征/锯齿征,存在纵隔脂肪线,侵犯胸膜、心包、大血管存在相关性(P<0.05),与外观是否呈分叶征无关(P>0.05)。结论胸腺瘤组织CKP、VEGF表达与MSCT检查特征密切相关,可为临床诊治胸腺瘤提供可靠参考依据。

羊毛KAPs家族基因及转录因子AP-1调控作用预测的研究进展

羊毛是养殖业重要的畜产品,具有较高的经济价值。角蛋白关联蛋白(KAPs)是羊毛纤维主要的蛋白质成分,包含诸多亚家族,构成了羊毛的主体,同时也决定了羊毛的各类经济性状。羊毛生长发育过程中角蛋白关联蛋白基因(KRTAPs)受到各种转录因子调控,KRTAPs表达具有高度的组织特异性和时空性,转录因子是KRTAPs表达的核心调控因素。本文主要从KAPs分类及其家族基因与羊毛性状的关系、转录因子AP-1的分类和功能以及KRTAPs启动子区域AP-1结合位点的预测等方面进行概述,以期为探究羊毛组分及其基因相关功能和羊毛性状的分子育种提供理论参考。

Hoxc13在毛囊发育中的作用

Hoxc13属于Hox(Homobox)基因家族Abd-B类成员之一,与毛囊形成和毛发生长密切相关。毛发结构蛋白KP(角蛋白)和KAP(角蛋白关联蛋白)的表达都受Hoxc13的严格调控,Hoxc13表达水平会直接影响毛发的特性,对维持毛囊的正常形态也至关重要。文章就Hoxc13的表达水平对毛囊发育和毛发生长的影响及Hoxc13与相关基因的调控进行了综述。

山羊KAP8.2基因的克隆表达及分析

目的:研究不同品种山羊和驯鹿高甘氨酸/酪氨酸(HGTKAPs)Ⅰ型蛋白KAP8.2在核苷酸和氨基酸水平的差异,以及KAP8.2mRNA在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达。方法:以阿尔巴斯白绒山羊KAP8.2设计特异引物,扩增马头山羊、吐根堡奶山羊、藏山羊和驯鹿KAP8.2基因的编码区,克隆测序并分析。体外制备地高辛标记的KAP8.2cRNA探针,通过原位杂交法在山羊皮肤组织切片上进行定位。结果:发现KAP8.2编码区在核苷酸和氨基酸水平的同源性较高,但也有差异,这可能是毛发性质不同的诸多原因之一。KAP8.2mRNA在成年10月份皮肤、胚胎125d皮肤初级和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达。结论:KAP8.2是胚胎和成年山羊皮肤初级和次级毛囊的皮质层的组成成分,不同地区、不同品种山羊及驯鹿的KAP8.2在核苷酸和氨基酸水平同源性较高。

山羊KAP6-1.2基因的克隆表达及分析

目的:研究角蛋白关联蛋白KAP6-1.2对不同品种羊绒和羊毛在核苷酸和氨基酸水平上的影响及在山羊皮肤中的定位表达。方法:以阿尔巴斯白绒山羊KAP6-1.2 cDNA设计特异引物,扩增5种山羊的KAP6-1.2基因的编码区,克隆并测序。制备KAP6-1.2 cRNA探针,通过组织切片原位杂交在皮肤中进行定位表达分析。结果:6种山羊的KAP6-1.2在核苷酸和氨基酸水平上高度同源,仅吐根堡奶山羊的编码区有2个碱基与其他5种山羊不同,导致编码的两个氨基酸残基也发生了改变。原位杂交结果显示,KAP6-1.2 mRNA在10月份皮肤、胚胎125d皮肤、胚胎115d皮肤初级和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达。结论:KAP6-1.2的核苷酸序列和氨基酸序列在不同地区、不同品种山羊中高度保守,在胚胎和成年山羊皮肤的初级和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达。

KAP6基因家族成员在胚胎期山羊皮肤中的表达

为研究KAP6家族成员在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊胚胎期皮肤毛囊中的表达,在体外合成用地高辛标记的阿尔巴斯白绒山羊KAP6基因家族成员的cRNA探针,通过原位杂交法在山羊皮肤组织切片上进行定位,检测KAP6 mRNA在绒山羊胚胎期皮肤组织中的表达情况。结果发现,KAP6 mRNA在初级毛囊和次级毛囊的皮质层有强烈的表达信号,表明KAP6是绒山羊毛和绒皮质蛋白的组成成分,是皮质层中起角质化作用的重要蛋白质,直接参与了绒毛和粗毛的合成,对毛发的理化性质有重要作用。

HGT KAPs基因家族成员在山羊皮肤中的表达

利用经体外合成、用地高辛标记的阿尔巴斯白绒山羊高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白(HGT KAPs)基因家族9个成员的cRNA探针,通过原位杂交技术在山羊皮肤组织切片上进行定位,探测HGT KAPs基因家族9个成员在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊10月份皮肤毛囊中的表达。结果表明:HGT KAPs在兴盛期初级毛囊和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达信号。这说明HGT KAPs是绒山羊毛和绒皮质蛋白的组成成分,是皮质层中起角质化作用的重要蛋白质,直接参与绒毛和粗毛的合成,对毛发的理化性质具有重要作用。

绵羊KAP1．3基因的多态性及其与羊毛性状的关系

利用PCR-RFLP分子标记技术,研究KAP1.3基因与新疆5个不同绵羊品种之间的遗传关系。得出5种绵羊均处于中度多态,不同绵羊品种间遗传信息有所不同;选取在羊毛品质上具有不同表形值的中国美利奴羊,分析KAP1.3基因与毛性状之间的相关性,经多重比较分析得出:AB基因型标记的羊毛平均长度最长为13.54±0.4303cm,但各基因型间差异不显著;AA基因型标记的羊毛细度最细为18.13±0.4529μm,AA基因型与AB基因型间差异达到了显著水平(P<0.05),因此角蛋白关联蛋白的多基因家族的高硫蛋白辅助基因KAP1.3与羊毛细度间可能存在相关性。

KAP7-1基因在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达

角蛋白关联蛋白是羊绒主要的结构蛋白之一,依据氨基酸的成分,基本上可分为超高硫、高硫和富含甘氨酸/酪氨酸三种角蛋白家族.从构建的成年山羊皮肤cDNA文库和ESTs分析中发现了与绵羊KAP7-1cDNA高度同源的gKAP7-1cDNA,在核苷酸水平的同源性达到96.8%,编码85个氨基酸,甘氨酸和酪氨酸的含量为30.12%.在GeneBank中的注册号是AY510121.1,有3个拷贝数.原位杂交显示它在皮肤初级毛囊的皮质层、表皮层和次级毛囊的皮质层有强烈的表达.

慢病毒介导小鼠K26/KAP26.1基因过表达对相关基因的调控作用

【目的】利用慢病毒介导过表达技术,明确小鼠K26和KAP26.1基因过表达后对角蛋白关联蛋白基因KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1和对骨形态发生蛋白基因BMP-4、BMPR-IB的影响,探究小鼠绒毛细度变化的影响机制,达到人为调控(如慢病毒载体技术)使相关基因过表达,改善动物绒毛品质的目的,为哺乳动物绒毛细度调控的研究奠定理论基础,【方法】试验在辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室完成,小白鼠采自大连医科大学实验动物中心,选取出生后5周龄昆明种雄鼠。在Genebank查找到小鼠基因K26(Gene ID:NM_001033397)及KAP26.1(Gene ID:NM_027105.2)序列,根据目的基因序列设计引物,将质粒转入生长状态良好的293T细胞,构建小鼠K26和KAP26.1基因慢病毒过表达载体,将含有目的基因K26及KAP26.1的慢病毒表达载体分别转染小鼠皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察其转染情况,确定慢病毒表达载体转染成功后,从病毒感染后的细胞中抽提总RNA,将RNA反转录成c DNA后放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪,检测K26和KAP26.1基因过表达对KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因表达的影响。【结果】经RT-PCR检测,证明小鼠慢病毒载体p Lenti6.3-K26-IRES-EGFP和p Lenti6.3-K26.1-IRES-EGFP构建成功。经荧光场对比,发现目的慢病毒载体转染293T细胞72h时转染率最高。经PCR检测,证实包装好的目的慢病毒K26及KAP26.1转染小鼠成纤维细胞72 h后转染成功。经RT-PCR检测与SPSS Statistics 19软件分析目的基因表达量与阳性对照组(空载体质粒组,BLACK)、阴性对照组(小鼠表皮成纤维细胞,NC)表达量之间的显著性差异,发现K26基因过表达会导致KAP26.1基因上调,反之亦然,说明K26和KAP26.1基因之间存在一定的协同作用;K26和KAP26.1基因过表达后,均能导致KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因下调;K26基因过表达能使BMP-4基因表现为上调,而BMPR-IB基因表现为下调;KAP26.1基因过表达时,BMP-4和BMPR-IB基因均表现为上调。【结论】K26与KAP26.1基因在毛囊的内根鞘中起到协同作用,K26和KAP26.1基因的高表达会抑制KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因的表达,影响m TOR下游蛋白合成信号,进而起到调节绒毛粗细的作用;K26和KAP26.1基因过表达均能使BMP-4基因表现为上调,BMP-4是BMP信号通路的激活剂,能够激活BMP信号通路向下游转导,进而影响到毛囊的发育周期;K26基因过表达下调BMPR-IB基因的表达,而KAP26.1基因过表达上调BMPR-IB基因的表达,BMPR-IB基因是BMP信号的Ⅰ型受体,当BMPR-IB受体减少时,会抑制BMP信号向下游转导,从而使绒毛生长周期重新开始;当BMPR-IB受体增加时,会促进下游信号分子转录,进而影响毛囊发育周期。说明K26和KAP26.1基因过表达均能激活BMP信号通路,并由BMP和m TOR信号调节KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因的表达,但K26与KAP26.1基因对BMPR-IB基因的相反调节作用有待深入研究。

羊驼皮肤cDNA文库构建及鉴定

采用原核表达载体pet-32-a+构建了羊驼皮肤组织cDNA文库。双链cDNA采用Universal Ribo Clonec DNA Synthesis System合成,并经过琼脂糖分级胶回收,去除了小于400 bp的片断;通过酶切载体的去磷酸化和插入片断的磷酸化,提高了重组率,蓝白斑筛选结果全部为阳性;库扩增后检测容量达2.25×107。随机挑取阳性克隆进行单引物测序分析,七个测序样品中获得两个与毛发生长相关的EST(expression sequence tag),分别为S100钙离子结合蛋白A3基因(S100 calcium binding protein A3,S100A3)的部分序列和高硫角蛋白关联蛋白基因(high sulfur keratin-associated protein,KRTAP3-3)的部分序列,说明所构建的文库具有较高的代表性。