祛银颗粒对角质形成细胞生长因子诱导的HaCaT细胞增殖及分泌TNF-α的影响

目的探寻中药组方祛银颗粒治疗银屑病的作用机制。方法体外培养HaCaT细胞,以10 ng/mL的KGF刺激HaCaT细胞增殖的方法建立银屑病的细胞模型。用祛银颗粒不同浓度含药血清干预细胞,倒置显微镜下观察药物作用后的细胞生长状态,ELISA法检测细胞分泌TNF-α的影响,流式细胞仪检测药物血清对细胞增殖、细胞周期的影响。结果 48 h祛银颗粒低、中、高剂量组药物与模型组比较,对细胞均有抑制作用(P<0.05);祛银颗粒中、高剂量组抑制作用与维A酸组差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪检测显示:在细胞合成S期,祛银颗粒高剂量组同期细胞数量较模型组减少(P<0.05),与维A酸组相近(P>0.05)。祛银颗粒高剂量组与模型组比较,分泌的TNF-α降低(P<0.05)。结论祛银颗粒含药血清具有抑制KGF诱导的HaCaT细胞增殖的作用,并可抑制细胞分泌TNF-α,提示抑制表皮增殖和抑制细胞产生炎症因子可能是祛银颗粒发挥治疗银屑病的作用机制之一。

转化生长因子β1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响

背景:研究认为衰老和光老化状态下生长因子的表达不一定一致,生长因子与皮肤老化的关系越来越受到重视。目的:验证转化生长因子β1对长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响。设计、时间及地点:以体外培养细胞为观察对象,随机重复实验,于2006-07/2008-03在解放军第四军医大学全军整形外科研究所进行。材料:成纤维细胞来自解放军第四军医大学整形外科门诊患者包皮,采用组织块法培养获得。方法:通过酶联免疫法(ELISA)使用不同剂量长波紫外线(0,5,10,20J/cm2)照射体外培养的皮肤成纤维细胞,测定上清液中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子的质量浓度;以长波紫外线15J/cm2为照射剂量,选择不同剂量转化生长因子β1即小剂量组(0.1μg/L)、中剂量组(1μg/L)、大剂量组(10μg/L)对培养的皮肤成纤维细胞进行干预。主要观察指标:不同剂量长波紫外线照射、以及转化生长因子β1处理后皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子的表达。结果:长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子分泌水平下降,血管内皮细胞生长因子分泌升高;转化生长因子β1处理后,转化生长因子β1剂量依赖性地提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌的3种细胞因子的水平。转化生长因子β1大剂量组胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子含量明显高于长波紫外线照射组(P<0.01)。结论:长波紫外线照射抑制体外培养成纤维细胞中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子表达,促进血管内皮细胞生长因子表达。转化生长因子β1可提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子3种细胞因子的水平,有利于真皮内结构的恢复和重建。

他扎罗汀抑制角质形成细胞血管内皮生长因子的表达

目的 探讨他扎罗汀治疗银屑病等的作用机制。方法 用免疫组化方法检测他扎罗汀对培养的角质形成细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响 ,用双抗体夹心ELISA法定量检测他扎罗汀对培养的角质形成细胞上清液中VEGF分泌的影响。结果 免疫组化染色表明他扎罗汀可以减少培养的角质形成细胞VEGF的产生 ,表现为角质形成细胞染色强度明显减弱。角质形成细胞培养上清液检测表明 ,他扎罗汀可明显减低角质形成细胞VEGF的分泌 ,并呈剂量依赖性 ,10 -8mol/L他扎罗汀即可使角质形成细胞VEGF分泌减少 40 %左右 (P <0 .0 1)。结论 他扎罗汀治疗银屑病的机制之一可能在于减少银屑病病人角质形成细胞VEGF分泌 ,从而改善银屑病皮损的血管扩张、增生等病理改变 ,进而减轻炎症细胞浸润及炎症反应。

角质细胞生长因子(KGF)对人卵泡颗粒细胞内Ca^(2+)浓度和DNA合成的影响

目的:探讨角质细胞生长因子(KGF)对人卵巢颗粒细胞内Ca^(2+) 浓度及DNA 合成的影响。方法:从体外受精-胚胎移植取卵时的卵泡液中分离出颗粒细胞(n=20),体外培养,采用3H-TdR 及黏附式细胞仪检测在KGF诱导下颗粒细胞内的Ca^(2+)浓度和DNA合成的变化。结果:加入KGF后,颗粒细胞内的Ca^(2+)浓度和DNA合成显著增加(P<0.01)。结论:KGF可以促进人卵泡颗粒细胞内Ca^(2+)浓度升高和DNA合成增多。

他扎罗汀对角质形成细胞体外增殖及分泌转化生长因子β1的影响

对正常人表皮角质形成细胞(KC)进行原代培养,通过细胞计数、细胞增殖试验(亚甲蓝染色)及ELISA方法检测转化生长因子β1(TGF-β1)的含量等体外观察他扎罗汀对KC的药理作用及其对KC分泌TGF-β1含量的影响。结果新一代受体选择的维A酸药物他扎罗汀可明显抑制KC的生长,具有时间和浓度依赖性特点;且可提升KC分泌TGF-β1的含量。由此可见,他扎罗汀可通过提升KC分泌TGF-β1的含量来进一步抑制KC的增殖。

人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白抑制角质形成细胞生长因子诱导的细胞自噬

目的研究人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白对角质形成细胞生长因子(KGF)诱导的细胞自噬的影响。方法构建HPV16 E5蛋白真核表达载体p CI-neo-E5,采用LipofectamineTM2000转染至Ha Ca T人角质形成细胞,实时定量PCR检测HPV16 E5 mRNA转录水平。转染p CI-neo-E5并以KGF刺激Ha Ca T细胞后,实时定量PCR检测自噬相关蛋白beclin 1、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7及LC3B mRNA的水平,Western blot法检测LC3BⅡ蛋白的表达量,免疫荧光技术检测LC3B的分布。结果成功构建HPV16 E5真核表达载体p CI-neo-E5并可有效表达。角质形成细胞转染p CI-neo-E5,自噬相关蛋白mRNA的水平显著降低,抑制KGF诱导的LC3BⅡ表达水平升高和LC3B的聚集。结论 HPV16 E5蛋白通过下调自噬相关蛋白的表达,抑制KGF诱导的细胞自噬。

窄谱中波紫外线对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响

目的研究窄谱中波紫外线(NB-UVB)对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)mRNA表达的影响。方法用50 mJ/cm2和100 mJ/cm2NB-UVB照射正常人KC后继续培养12 h,用MTT法和实时荧光定量RT-PCR法分别检测KC增殖和HB-EGF mRNA的改变。结果NB-UVB照射正常人KC后,可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB-EGF mRNA的表达。50 mJ/cm2和100 mJ/cm2NB-UVB照射后,分别使KC增殖抑制5.4%和8.7%,使HB-EGF mRNA增加到正常对照组的1.7倍和2.5倍。结论NB-UVB抑制KC的增殖部分是通过上调HB-EGF的表达介导的。

表没食子儿茶素没食子酸酯对紫外线诱导的角质形成细胞分泌血管内皮生长因子的影响

目的:研究绿茶中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞HaCaT株(简称Ha-CaT细胞)分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:试验共设立空白对照组、单纯加药组、单纯照光组和加药照光组4组,以15mJ/cm2UVB的剂量照射细胞,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测不同时间细胞上清液中VEGF含量,反转录(RT)-PCR测定VEGFmRNA表达。结果:UVB照射后,HaCaT细胞分泌的VEGF在照光后12h开始明显增加,随时间延长,VEGF水平逐渐增加。EGCG对UVB诱导的VEGF升高有明显抑制作用。在12、18、24h3个时间点,EGCG明显抑制VEGF水平的升高。结论:EGCG可以抑制紫外线诱导的HaCaT细胞分泌VEGF。

依曲替酸对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响

目的研究依曲替酸对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)mRNA表达的影响。方法0.1和1μmol/L伊曲替酸处理正常人KC 12 h后,用噻唑蓝比色法(MTT法)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测KC增殖和HB-EGF mRNA表达的改变。结果依曲替酸处理12 h后,可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB-EGF mRNA的表达。0.1和1μmol/L伊曲替酸分别使KC增殖抑制10.2%和14.4%,使HB-EGF mRNA增加到正常对照组的3.2和7.1倍。与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论依曲替酸可剂量依赖上调HB-EGF mRNA的表达,其可能参与依曲替酸对KC增殖的抑制作用。

人表皮生长因子基因转染原代角质形成细胞

目的：将带信号肽的人表皮生长网子基因转染原代成人角质肜成细胞，证实细胞活性及hEGF的有效表达，为后期的皮肤修复研究打下基础。方法：先酶切验证pcDNA3．1－hEGF，后消化成人皮肤组织，以Defined Keratinocyte—SFM（DKSFM）传代培养角质形成细胞并鉴定，脂质体转染质粒pcDNA3．1－hEGF人细胞，转基因细胞培养48h再作RT－PCR和Western—blot分析，上清分别进行放射免疫测定和MTT测定。结果：质粒peDNA3．1－hEGF上的hEGF序列经测序证实，双酶切后获得约230bp和5．4kb条带；成人角质形成细胞体外培养可快速稳定增殖，转hEGF基因细胞经RT—PCR扩增出一条约230bp的特异性条带。Westem—blot检测到hEGF表达明显升高；放射免疫法和MTT实验证实转基因细胞有稳定的hEGF蛋白分泌。结论：质粒pcDNA3．1－hEGF在脂质体介导下成功转染成人皮肤角质形成细胞，转基因细胞能分泌有生物活性的EGF；体外培养的成人皮肤角质形成细胞可见少量EGF分泌．

角质形成细胞生长因子的研究进展

角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor．KGF）是由间质细胞分泌的，通过旁分泌途径刺激上皮增殖的细胞因子。研究表明KGF在组织修复过程中发挥着很重要的作用，这些作用主要是KGF通过加强上皮屏障功能完成，包括促进细胞的增殖、迁移、分化、存活等。重组人角质形成细胞生长因子Palifermin己由FDA批准用于治疗放化疗导致的严重口腔粘膜炎。本文将对KGF的生物学特性、表达调控、生物学功能、及重组KGF的研究和应用进行讨论。

角质形成细胞生长因子促进大鼠皮肤伤口局部血管化效果研究

目的:探索角质形成细胞生长因子(Keratinocyte growth factor,KGF)对于大鼠皮肤伤口局部的促血管化作用。以探究其可能的促进愈合的机理。方法:构建大鼠背部皮肤全层缺损模型,随机分为空白组(不作特殊处理),空白膜组(放置空白胶原膜),KGF膜组(放置加载KGF的胶原膜)。通过大体标本观察,组织学染色、免疫双标染色等技术对术后7d和14d时伤口的血管化程度进行比较和分析。结果:术后通过大体标本观察,可看到空白组和空白膜组虽均有血管长入伤口内,但中心部位血管化程度低于KGF膜组。Masson染色和免疫荧光染色及局部血管计数也证实加载KGF的胶原膜可以促进局部血管再生。结论:KGF可以促进大鼠皮肤伤口愈合过程中的血管化作用。

角质形成细胞生长因子对HaCaT细胞增殖的影响

目的:研究角质形成细胞生长因子(KGF)对HaCaT细胞增殖的影响,探讨KGF与银屑病表皮过度增殖的关系。方法:利用HaCaT细胞体外培养,采用KGF为增殖诱导剂,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度的KGF对HaCaT细胞增殖率的影响;检测KGF对细胞生长曲线及细胞集落形成的影响。结果:MTT实验表明,KGF可刺激HaCaT细胞增殖,刺激作用呈浓度依赖性(r=0.981,P<0.05);10 ng/mL KGF作用下HaCaT细胞的生长速度较对照组明显加快(P<0.05),集落形成率较对照组增加(P<0.05),且细胞呈明显的增殖形态,形成的集落较大,集落内细胞多呈星状,胞内染色质丰富。结论:KGF具有显著的促HaCaT细胞增殖作用,银屑病皮损区域KGF表达增加可能是引起表皮过度增殖的重要致病因子。

结缔组织生长因子在口腔黏膜下纤维性变组织中的角质形成细胞中的表达

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)在口腔黏膜下纤维性变(OSF)发病机理中的作用。方法应用原位杂交法对34例OSF、10例正常口腔黏膜组织角质形成细胞(KC)中CTGFmRNA进行检测。结果24例(70.6%)OSF组织KC中有CTGFmRNA表达,早期OSF组织KC中CTGFmRNA阳性表达明显高于中晚期OSF(P<0.05),10例正常口腔黏膜组织KC中CTGFmRNA表达呈阴性。结论OSF组织KC可合成分泌CTGF,在OSF发病机理中CTGF可能起重要作用,CTGF可能作为一中间介质参与了OSF的发病过程。

人角质形成细胞Notch信号通路与转化生长因子β调控受体蛋白的作用

背景:在皮肤中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的调控至关重要,而转化生长因子β似乎是其调控的上游因子,既然Notch信号和转化生长因子β信号通道如此相关,那么Notch是不是也参加了转化生长因子β信号对受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的调控呢?目的:探讨Notch信号通道在人角质形成细胞中对转化生长因子β调控受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的作用的影响。方法:在分别用Jagged-1激活和用Γ-分泌酶抑制剂抑制Notch信号通道后,加入转化生长因子β,同时设立对照组,用Real-timePCR测试人角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappamRNA表达量。结果与结论:覆盖率为40%的角质形成细胞在加入了转化生长因子β后,受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappamRNA量在各时间点均高于对照组。在用Jagged-1激活Notch通道的角质形成细胞中,单独加入Jagged-1、转化生长因子β及两者都加入时均高于对照组(P<0.05,P<0.01)。在用γ-分泌酶抑制剂抑制Notch通道的角质形成细胞中,只加入转化生长因子β显著高于对照组(P<0.01),只加入γ-分泌酶抑制剂和两者均加入时与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。说明加入转化生长因子β导致角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达增加,而分别对Notch信号进行激活和抑制后发现,受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa信号分别显著增加和显著被抑制。所以在转化生长因子β升高受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达过程中Notch信号通道是非常重要且不可或缺的。

表皮细胞生长因子对角质形成细胞体外增殖作用的研究

目的:观察重组人表皮生长因子(Recombinant human epidermal growthfactor,rhEGF)对人角质形成细胞的细胞周期以及促切口愈合作用。方法:运用包皮环切术后收集培养角质细胞,不同浓度的重组人表皮细胞生长因子处理细胞,MTT法、3HtdR掺入法测细胞生长率;流式细胞仪检测细胞周期。结果:体外实验表明5～100ng.ml-1重组人表皮细胞生长因子可促进人角质形成细胞生长,其中浓度为10ng.ml-1促进细胞生长作用最为显著。流式细胞仪检测10 ng.ml-1重组人表皮细胞生长因子处理后细胞增殖明显,S和G2/M期细胞数明显增加。结论:重组人表皮细胞生长因子可促进细胞生长。

重组角质细胞生长因子(KGF)的原核表达及优化

[目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMOKGF(ΔN23)和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF(ΔN23),并测试不同表达温度(37、23℃)对KGF(ΔN23)表达结果的影响。[结果]在BL21(DE3)菌株中,37℃表达时KGF(ΔN23),SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)的表达量都较高,其中可溶性蛋白表达量KGF(ΔN23)<SUMO-KGF(ΔN23)<Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)。降低诱导温度为23℃后,3种KGF的表达量都显著降低,但是可溶性蛋白的占比显著提高,均接近100%。[结论]降低诱导温度能够促进KGF的可溶性表达,但是总蛋白的表达水平显著下降;与可溶性标签蛋白融合表达能够提高KGF在37℃表达时可溶性蛋白占比,其中融合Fh8-SUMO标签的KGF表达量和可溶性蛋白占比较高。

白疕合剂对体外培养人永生化角质形成细胞分泌血管内皮生长因子及其受体2表达的影响

目的观察中药白疕合剂干预人永生化角质形成细胞(HaC aT细胞)后,对其血管内皮生长因子(VEGF)的分泌量及其受体2(VEGFR-2)基因和蛋白表达的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养HaC aT细胞建立银屑病实验模型。SD大鼠随机分为空白血清组、阿维A组和白疕合剂低、中、高剂量组,并单设空白对照组。给药后制备血清,干预HaC aT细胞模型。ELISA检测VEGF分泌量,RT-PCR检测VEGFR-2基因表达,Western blot检测VEGFR-2蛋白表达。结果与空白对照组比较,白疕合剂低、中、高剂量组干预HaC a T细胞后,VEGF分泌量及VEGFR-2基因和蛋白表达均明显抑制,且呈浓度依赖性。结论白疕合剂可能通过抑制VEGF分泌量、降低VEGFR-2基因和蛋白表达以达到治疗银屑病的作用。