纳米螺旋-解旋-再螺旋首次人工实现

据报道,中国科学院合肥物质科学研究院强磁场中心与南京大学陆轻铱教授、高峰教授课题组,中国科技大学等单位合作,依托该院稳态强磁场实验装置(SHMFF),发现一种晶体结构中微妙的竞争和协作关系,在螺旋和解旋产物晶体结构之间建立了微妙的能量平衡,首次实现了纳米线与纳米螺旋之间的多重可逆变化。研究成果日前在线发表于《自然·通讯》上。

嗜热菌PIF1解旋酶的生化活性研究

小整合频率1(petite integration frequency 1,PIF1)解旋酶广泛存在于生物体内,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用。近年来,人们已经报道了多种PIF1解旋酶的生化活性及三维结构,但对极端环境下细菌的PIF1解旋酶的报道仍较少。本文利用多种生物化学与生物物理学技术,对黄石热脱硫弧菌PIF1(Ty.PIF1)解旋酶进行了多方面研究。通过原核表达纯化系统,获得了纯度90%以上,均一性好的Ty.PIF1蛋白。Ty.PIF1在溶液中为单体,分子量约为60 kD。Ty.PIF1具有很高的热稳定性,在65℃以下时,二级结构保持稳定,大于70℃时,二级结构才会发生改变。Ty.PIF1在体外最适解旋温度为45℃,并非黄石热脱硫弧菌生存的最适温度,预示着Ty.PIF1在体内发挥活性时,可能需要其他辅助因子的参与。Ty.PIF1的酶活力温度范围较宽,在20~55℃均具有解旋活性,在55℃能解旋预示了Ty.PIF1具有耐热特性。Ty.PIF1偏向于同含有单链的底物结合,但对单链长度有一定要求,其长度至少大于4 nt;Ty.PIF1也会较好地结合无单链尾链的G4结构,说明Ty.PIF1可能有专门结合G4结构的区域。Ty.PIF1能解开一系列带有5′-单链尾链的类似于复制中间体的底物,且对底物结构有一定的偏好性;Ty.PIF1也可以解开含有G4结构的底物,DNA-RNA杂交链、RNA-loop结构,预示着Ty.PIF1在生物体内有着多种生物学功能。Ty.PIF1解旋带有不同长度5′-单链尾链的双链底物时,尾链长度越长,解旋速率越快,预示着Ty.PIF1可能与Sc.PIF1一样有着较低的解旋持续性。本文将Ty.PIF1的生化活性与其它物种的PIF1解旋酶进行了比较,找出了其中的共性与差异,加深了人们对嗜热菌PIF1解旋酶的认识,为今后研究其它极端环境微生物的PIF1解旋酶提供了一些思路。

易通过冷冻食品传播的新冠病毒解旋酶的表达纯化及酶活研究

通过原核表达方式纯化得到新冠病毒解旋酶(SARS-CoV-2-Nsp13),并利用荧光各向异性和凝胶阻滞试验探究了其体外结合DNA、RNA底物的亲和力及解旋双链DNA的最佳解旋条件。结果表明,SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有结合单链DNA(ssDNA)、带有5'尾链的双链DNA(5'Oh-dsDNA)及RNA发卡结构(RNA-HP)的活力,亲和性依次为5'Oh-dsDNA≈RNA-HP>ssDNA,结合曲线呈S型。SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶与DNA、RNA底物的结合具有协同性。SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶可以解旋带有5'尾链的双链DNA,解旋的方向为5'-3',发挥完全解旋活性的酶浓度为3μmol/L;而该解旋酶解旋DNA双链的活性相对较弱,解旋活性在NaCl浓度达到80 mmol/L时受到明显的抑制。研究结论可为深入理解冠状病毒解旋酶的生化活性及工作机理提供参考和帮助。

牛、果蝇DHX36解旋酶的表达纯化及活性比较

【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、反应温度37℃。在此条件下,2种同源DHX36均可结合多种类型核酸底物(ssRNA、ssDNA、parallel G4、anti-parallel G4),且BtDHX36结合平行结构G4底物(parallel G4)的倾向更明显,DmDHX36无此趋势;2种DHX36解旋酶结合不同长度ssDNA的能力不同,BtDHX36更倾向于结合较长的单链DNA底物,而DmDHX36更倾向于结合较短的单链DNA底物;二者均能高效解旋dsRNA和dsDNA底物,DmDHX36更倾向于解旋dsDNA,而BtDHX36无明显倾向性。【结论】成功表达并纯化了BtDHX36和DmDHX36蛋白,确定了其最适结合条件,比较了2种DHX36解旋酶对不同底物的结合及解旋偏好。

嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析

已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶(Defe.Pif1)结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ss DNA与G4 DNA,并对含3'-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为:ss DNA>G4 DNA>3'-ss DNA-ds DNA≈Y-structure>Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L Na Cl、3mmol/L DTT、3 mmol/L Mg Cl2及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5'-G4-ds DNA底物时的解旋幅度超过90%,解旋速率也与其解旋5'-ss-ds DNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性:与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt-bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt-bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。

厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。

热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Thermodesulfovibrio yellowstonii H.）Pif1解旋酶（TyPif1）,研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21（DE3）菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（CD）和荧光共振能量转移（FRET）分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1。【结论】表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4DNA的能力。

一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析

【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(Deferribacter desulfuricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-DePif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5′26nt tail和dsDNA with 5′26nt tail)的解旋活性。【结果】每升菌液可获得9 mg纯度大于95%的DePif1解旋酶。DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA>单链DNA>双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA。【结论】成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力。

天花粉蛋白质与苦瓜子蛋白质改变DNA构型的活性I.DNA解旋与链结

为研究中药有效成分天花粉蛋白质（ＴＣＳ）与苦瓜子蛋白质（ ＭＭＣ）的生物学活性，以 细胞遗传物质ＤＮＡ为底物，经分子生物学技术分析，发现超盘旋双链ＤＮＡ发生解旋和链结，单链 ＤＮＡ发生断链，在合适条件下，已解旋和断链的分子还可重新盘绕，再成超盘旋，极微量的蛋白质 即表现出很强的作用。这一活性与１型ＤＮＡ拓扑异构酶相同。

甲基丙烯酸三苯墓甲酯和甲基丙烯酸酯类的共聚物在溶液中的螺旋诱导和解旋作用

甲基丙烯酸三苯墓甲酯和甲基丙烯酸酯类的共聚物在溶液中的螺旋诱导和解旋作用陈传福，刘卫宏，陈永明，任长玉，习复（中国科学院化学研究所北京１０００８０）关键词甲基丙烯酸三苯基甲酯，甲基丙烯酸甲酯，光学活性，螺旋诱导，解旋在手性阴离子复合引发剂存在下，甲基...

速度向量成像技术对扩张型心肌病左室扭转及解旋运动的评价作用观察

目的评价扩张型心肌病（DCM）患者的左室扭转及解旋特征。方法选取DCM患者19例,其中男17例,女2例,年龄50.5±17.5（18～82）岁;健康对照组21例,其中男16例,女5例,年龄49.1±16.9（18～80）岁。留取心底部、心尖部短轴切面二维灰阶图像,应用速度向量成像技术获得左室各节段及整体的旋转角度及旋转速度,计算左心室扭转角度、扭转速度、解旋速度和解旋率。结果 DCM患者左室心底部及心尖部心肌旋转角度、旋转速度随心动周期变化曲线明显紊乱;与对照组比较,DCM患者收缩期左心室心底部和心尖部旋转角度、旋转速度均显著降低,DCM患者左室整体扭转角度为（6.5±1.8）°,扭转速度为（67.8±15.6）°/s,显著低于对照组（P〈0.01）;DCM患者左室解旋率及解旋速度亦显著低于对照组（P〈0.01）。结论 DCM患者左室整体扭转角度、扭转速度显著减小,左室解旋速度显著降低,并且左室解旋率受前负荷的影响。

应用解旋恒温基因扩增技术检测沙门氏杆菌

为寻求快速简便的检测沙门氏杆菌及其他病原生物新方法,以沙门氏杆菌invA基因为目的片段,设计特异性引物,通过条件优化,建立了检测沙门氏杆菌的HDA法,用4株沙门氏杆菌和6种其他病原菌(大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌)考核特异性,用稀释法测定灵敏度.结果表明,本研究建立的HDA法可在恒温水浴锅中进行,扩增时程75 min;阳性检测率为100%,无假阳性;用HAD法检测12份饲料样品,结果检出沙门氏杆菌呈阳性的3份,阳性率为25%.HDA法极适合基层实验室使用.

恒温解旋扩增技术的改进和发展

恒温解旋扩增技术（Helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA）是纽英伦生物实验室美籍华人KONG Hui-min于2004年发展建立的一种核酸等温扩增技术[1],它模仿生物体内DNA的合成,在恒温条件下（62℃或37℃）凭借解旋酶解开双链DNA,然后引物与模板特异性结合,在DNA聚合酶的作用下合成互补链,进行特异性基因的扩增[2].

斑点追踪超声心动图技术评价正常成人左室旋转及解旋运动

目的应用斑点追踪超声心动图(STE)技术,研究正常成人左室旋转运动特征。方法选取我院健康体检者30例,取胸骨旁左室基底部及心尖部短轴扫查平面,对左室旋转进行测量分析,测量左室基底段和心尖段等容收缩期旋转角度、射血期旋转角度、等容舒张期旋转角度,计算等容舒张期解旋率,并将各项指标与年龄进行相关性分析。结果正常成人心脏的左室旋转运动主要表现为基底部顺时针旋转和心尖部逆时针旋转形成的相反运动,收缩末后立即发生快速解旋运动。左室射血期旋转角度与年龄呈正相关(P>0.05);等容收缩期旋转角度与年龄呈负相关,基底段有统计学意义(P<0.05),心尖段无统计学意义(P>0.05);等容舒张期解旋率与年龄呈负相关(P<0.05)。结论 STE技术可以无创评价正常成人左室旋转和解旋运动。

DnaB解旋酶与DnaI装载蛋白结构相互作用的研究进展

DNA复制是生命现象最本质的内容,由众多蛋白共同参与的能确保遗传信息精确及时传递的复杂的生物学过程。目前对DNA复制起始及其调控的分子机制了解还不很清楚。通过对研究解旋酶DnaB及装载蛋白DnaI的文献调研,希望有助于人们进一步了解DNA复制起始的一系列复杂过程。此外,研究DnaB与DnaI的相互抑制作用,也可为后续细菌抗生素的研究奠定基础,是新一代抗生素的研究方向之一。

解旋恒温基因扩增技术在螨虫鉴定中的应用前景

螨虫种类多,分布广,危害多样,已成为人们关注的对象。随着进出口植物、植物产品和食品的增加,其携带螨虫的风险越来越高,许多国家把螨虫作为检疫对象设置技术壁垒。由于螨虫体型微小,形态鉴定比较困难,一直是口岸检疫的一大难点。随着现代分子技术的发展,迫切需要建立快速、灵敏、准确的螨类检测方法。解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)是一种简便、快速、高效、灵敏度高的体外恒温基因扩增技术。该技术依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。HDA不需要昂贵的仪器设备,适用于基层实验室。HAD能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和c DNA等,从其灵敏性、准确性和可操作性几方面来看,该方法适用于螨虫鉴定。

二维斑点追踪技术评价不同冠脉病变支数对冠心病患者左室解旋运动的影响

目的探讨二维斑点追踪(2DSTI)技术评价不同冠脉病变支数对冠心病患者左室解旋运动的影响,为准确评估冠心病患者左室舒张功能提供依据。方法 75例疑为冠心病的患者根据冠脉造影结果分为冠心病组45例(其中单支病变组27例和多支病变组18例)和对照组30例。应用2DSTI技术测量左室峰值扭转角度(Ptw)、峰值扭转角速度(PTV)、收缩末期扭转角度(AVCtw)、等容舒张末期扭转角度(MVOtw)、等容舒张期左室解旋率(Untw-R)、解旋速度峰值(PUV)、解旋角速度达峰时间(T-PUV)及解旋减半时间(UHT)。结果与对照组比较,冠心病组患者Ptw、PTV及PUV差异无统计学意义;冠心病组Untw-R低于对照组(P﹤0.001),T-PUV和UHT高于对照组(P﹤0.001)。多支病变组患者Untw-R和PUV明显低于单支病变组,T-PUV和UHT较对照组明显延长,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论冠心病患者左室解旋运动出现明显减低与延迟,多支冠脉狭窄患者左室解旋运动减低与延迟较单支冠脉狭窄患者更为明显。

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。

DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区(N-端181aa)与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。

斑点追踪技术评价左室扭转及解旋运动的研究进展

超声斑点追踪(STI)技术是评价心肌旋转、扭转及解旋运动的新技术。该技术不受心脏整体运动影响,且无角度依赖性。本文对STI在评价正常及病理状态下心脏扭转及解旋运动的应用研究作一综述。