应用解旋恒温基因扩增技术检测沙门氏杆菌

为寻求快速简便的检测沙门氏杆菌及其他病原生物新方法,以沙门氏杆菌invA基因为目的片段,设计特异性引物,通过条件优化,建立了检测沙门氏杆菌的HDA法,用4株沙门氏杆菌和6种其他病原菌(大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌)考核特异性,用稀释法测定灵敏度.结果表明,本研究建立的HDA法可在恒温水浴锅中进行,扩增时程75 min;阳性检测率为100%,无假阳性;用HAD法检测12份饲料样品,结果检出沙门氏杆菌呈阳性的3份,阳性率为25%.HDA法极适合基层实验室使用.

解旋恒温基因扩增技术在螨虫鉴定中的应用前景

螨虫种类多,分布广,危害多样,已成为人们关注的对象。随着进出口植物、植物产品和食品的增加,其携带螨虫的风险越来越高,许多国家把螨虫作为检疫对象设置技术壁垒。由于螨虫体型微小,形态鉴定比较困难,一直是口岸检疫的一大难点。随着现代分子技术的发展,迫切需要建立快速、灵敏、准确的螨类检测方法。解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)是一种简便、快速、高效、灵敏度高的体外恒温基因扩增技术。该技术依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。HDA不需要昂贵的仪器设备,适用于基层实验室。HAD能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和c DNA等,从其灵敏性、准确性和可操作性几方面来看,该方法适用于螨虫鉴定。

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童支原体肺炎早期诊断及疗效判断中的价值

目的 考察实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期临床诊断中的价值及其在评价MPP转归以及判断药物疗效中的作用。方法 选取社区获得性肺炎(CAP)住院患儿451例,所有患儿在入院24 h内采集血清标本,采用被动凝集试验检测肺炎支原体(MP)特异性抗体[MP抗体检测(MP-Ab)],并采集咽拭子标本提取MP-RNA(MP-SAT法)。对MPP患儿在完成大环内酯类药物治疗第1疗程、完成大环内酯类药物治疗第3疗程时复查MP-Ab和MP-RNA。根据MPP诊断标准将其分为MPP组(n=183)和非MPP组(n=268)。比较MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。对病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物的MPP患儿进行动态观察,考察在大环内酯类药物(阿奇霉素)治疗MP不同时间点(入院时、完成第1疗程和完成第3疗程时)MP-SAT和MP-Ab的阳性率以及患儿临床和影像学表现(咳嗽、发热、肺部体征和CT表现)变化情况。结果 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性比较差异无统计学意义(P>0.05);病程<7 d患儿组中MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于MP-Ab(P<0.001或P<0.05或P<0.01)。病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物治疗的MPP患儿共42例,该组患儿在入院时、完成阿奇霉素治疗第1疗程和完成阿奇霉素治疗第3疗程时,MP-SAT检测阳性率分别为88.09%(37/42)、88.09%(37/42)和9.52%(4/42);MP-Ab检测阳性率分别为26.19%(11/42)、100.00%(42/42)和100.00%(42/42),在不同时间点MP-SAT和MP-Ab阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。该组患儿完成第3疗程时MP-SAT阳性率较入院时明显下降(P<0.001),临床症状(咳嗽、发热)、肺部体征及肺部CT表现较入院时明显好转(均P<0.001),MP-SAT结果与临床症状、肺部体征及肺部影像学表现变化趋势相一致。结论 SAT检测MP-RNA可作为儿童MPP的早期诊断依据,同时也可作为评价MPP转归及判断临床治疗效果的指标。

基于多酶恒温快速扩增-侧向流层析联用技术的肉制品真实性研究

目的:基于多酶恒温快速扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)与封闭式侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)联用技术,建立肉制品真实性快速检测方法,解决实验室方法不适于基层与现场快检需求的问题。方法:通过GenBank筛选猪、牛、羊、鸡、鸭线粒体基因的特异序列,使用DNAStar Megalign软件比对种内保守、种间特异的靶片段,依据MIRA引物探针设计原则设计靶基因引物探针组,通过阳性对照、阴性对照、空白对照等方式系统筛选引物探针,确定猪、牛、羊、鸡、鸭的专属性引物探针,并采用反应体系、反应温度、反应时间筛选,优化完善特异性检测方法。对方法进行系统的方法学考察,包括DNA提取、灵敏度、检出限、假阳性与假阴性考察等,验证方法的有效性。结果:使用建立的方法与实时荧光聚合酶链式反应检测进行比对分析,方法的平均假阳性率为3.49%、假阴性率为3.54%,符合现场快检方法的要求。结论:本研究建立了牛、羊、猪、鸡、鸭5种常见肉类的MIRA-LFD技术,并证实了其有效性和可行性,实现了肉制品真实性的现场快检。

基于多交叉置换扩增和纳米生物传感技术快速检测肺炎支原体方法的建立

目的建立一种简单、灵敏、快速的肺炎支原体(MP)检测方法,并对其应用性进行验证和评价。方法利用多交叉置换扩增(MCDA)技术对肺炎支原体特异基因CARDS毒素基因进行扩增,利用侧流免疫层析生物传感(LFB)技术读取扩增结果,命名该方法为MP-MCDA-LFB。分析扩增反应在60~67℃(间隔1℃)的扩增效率,筛选最适反应温度;分析分别扩增10、20、30、40 min时能够检测到的最低核酸浓度,筛选最佳反应时间。利用10倍系列稀释的肺炎支原体核酸分析MP-MCDA-LFB方法的灵敏度和检测限,利用35株非肺炎支原体菌株分析MP-MCDA-LFB方法的特异性。利用MP-MCDA-LFB方法检测80份疑似MP感染的临床样本,并与RT-PCR法检测结果进行比较,分析MP-MCDA-LFB方法的临床应用性。结果MP-MCDA-LFB能够实现对肺炎支原体CARDS毒素基因的快速检测。其最佳反应温度为63℃,最短反应时间为40 min,整个检测过程可在1 h内。MP-MCDA-LFB方法具有较高的灵敏度和特异性,其检测限低至45 ng/L,与其他临床表现相似的病原体无交叉反应,特异性为100%。MP-MCDA-LFB方法从80份临床样本中检出45份阳性样本(56.3%),检出率与RT-PCR方法一致。结论本研究建立的以CARDS毒素基因为靶标的MP-MCDA-LFB检测方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优点,在基层医疗机构和现场检测具有较好的应用潜力。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望

赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景.

发酵乳中植物乳杆菌依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

通过依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)技术建立一种快速检测发酵乳中植物乳杆菌的方法。根据植物乳杆菌scrB基因序列(基因号为AJ579541.1)设计特异性引物,通过实验筛选出检测体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的较优含量,达到最优反应条件。所建立的HDA方法通过人工添加植物乳杆菌确定检出限,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过扩增产物电泳和序列比对分析验证方法一致性和稳定性。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中植物乳杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的适宜添加量分别为0.15μg和5.0μg,特异性良好,与涉及的其他菌株均未发生扩增,检出限为2.8×10^(1) CFU/g,扩增序列与设计序列长度(273 bp)一致且序列同源性为100%;本研究建立的方法可以快速检测发酵乳中植物乳杆菌,具有灵敏度高、操作简单、应用前景广等特点。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展

随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等的扩增,该法具有广阔的实用前景。

RNA恒温扩增实时检测痰标本结核分枝杆菌对肺结核的诊断价值

目的:探讨RNA恒温扩增实时检测(SAT)技术检测痰标本结核分枝杆菌(MTB)对肺结核的诊断价值.方法:选择2020年8月至2022年8月本院收治的1190例可疑活动性肺结核患者为研究对象.对患者痰标本行罗氏培养、抗酸染色、SAT检测,以痰培养结果为"金标准",分析SAT检测方法的诊断价值.结果:痰培养结果明确肺结核患者990例,非肺结核患者200例;SAT检测明确肺结核患者570例,非肺结核患者620例;罗氏培养法明确肺结核患者445例,非肺结核患者745例;抗酸染色法明确肺结核患者300例,非肺结核患者890例.与罗氏培养法及抗酸染色法比较,SAT检测对于肺结核诊断灵敏度、准确度、阳性预测值及阴性预测值分别为56.97%(564/990)、63.95%(761/1190)、98.95%(564/570)、31.29%(194/620),均高于罗氏培养法及抗酸染色法,差异均有统计学意义(P<0.05);特异度各检查方法比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:SAT检测痰标本MTB对肺结核诊断具有较高的应用价值,能在较短时间内提供诊断结果,且具有较高的诊断准确度,为临床进一步诊疗提供了可靠的参考依据.

结核感染T细胞斑点试验、结核分枝杆菌核酸恒温扩增检测及腺苷脱氨酶联合检测在结核性胸腔积液诊断中的价值

目的探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核分枝杆菌核酸恒温扩增检测(TB-SAT)、腺苷脱氨酶(ADA)联合检测对结核性胸腔积液的诊断价值。方法选择2021年1月至2021年12月于新乡医学院第一附属医院就诊的135例胸腔积液患者为研究对象,其中结核性胸腔积液患者83例,非结核性胸腔积液患者52例。135例患者均进行外周血T-SPOT.TB、胸腔积液TB-SAT和胸腔积液ADA检测,比较3种方法单独检测和联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度及特异度。结果T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度、特异度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。T-SPOT.TB+TB-SAT联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度显著高于T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测(χ^(2)=4.990、13.410、14.590,P<0.05);T-SPOT.TB+TB-SAT联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度与T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测比较差异均无统计学意义(χ^(2)=0.000、2.420、0.060,P>0.05)。T-SPOT.TB+ADA联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度显著高于ADA单独检测(χ^(2)=4.069,P<0.05),与T-SPOT.TB、TB-SAT单独检测比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.055、3.384,P>0.05)。T-SPOT.TB+ADA联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度显著低于T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测(χ^(2)=4.370、12.511、5.371,P<0.05)。TB-SAT+ADA联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度与T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测比较差异均无统计学意义(χ^(2)=0.000、2.604、3.213,P>0.05)。TB-SAT+ADA联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度显著低于TB-SAT单独检测(χ^(2)=5.765,P<0.05),与T-SPOT.TB、ADA单独检测比较差异均无统计学意义(χ^(2)=0.782、1.251,P>0.05)。T-SPOT.TB+TB-SAT+ADA三者联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度显著高于T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测(χ^(2)=6.760、15.755、16.966,P<0.05);T-SPOT.TB+TB-SAT+ADA三者联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度显著低于T-SPOT.TB、TB-SAT、ADA单独检测(χ^(2)=4.370、12.511、5.371,P<0.05)。T-SPOT.TB+TB-SAT联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度显著高于T-SPOT.TB+ADA、TB-SAT+ADA联合检测(χ^(2)=4.090、4.990,P<0.05);T-SPOT.TB+ADA联合检测与TB-SAT+ADA联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.060,P>0.05)。T-SPOT.TB+TB-SAT联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度显著高于T-SPOT.TB+ADA联合检测(χ^(2)=4.371,P<0.05);TB-SAT+ADA联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度与T-SPOT.TB+TB-SAT、T-SPOT.TB+ADA联合检测比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.780、1.490,P>0.05)。T-SPOT.TB+TB-SAT+ADA三者联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度与T-SPOT.TB+TB-SAT联合检测比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.210,P>0.05);T-SPOT.TB+TB-SAT+ADA三者联合检测诊断结核性胸腔积液的灵敏度显著高于T-SPOT.TB+ADA、TB-SAT+ADA联合检测(χ^(2)=5.750、6.760,P<0.05)。T-SPOT.TB+TB-SAT+ADA三者联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度显著低于T-SPOT.TB+TB-SAT联合检测(χ^(2)=4.370,P<0.05);T-SPOT.TB+TB-SAT+ADA三者联合检测诊断结核性胸腔积液的特异度与T-SPOT.TB+ADA、TB-SAT+ADA联合检测比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.000、1.490,P>0.05)。结论联合检测较单一检测诊断结核性胸腔积液效果理想,外周血T-SPOT.TB联合胸腔积液TB-SAT诊断结核性胸腔积液的总体效能最好。联合检测能有效降低漏诊率和误诊率,对结核性胸腔积液具有较高的临床应用价值。

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。

应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的:建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法:根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果:解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0μg。结论:解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。

恒温解旋扩增技术的改进和发展

恒温解旋扩增技术（Helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA）是纽英伦生物实验室美籍华人KONG Hui-min于2004年发展建立的一种核酸等温扩增技术[1],它模仿生物体内DNA的合成,在恒温条件下（62℃或37℃）凭借解旋酶解开双链DNA,然后引物与模板特异性结合,在DNA聚合酶的作用下合成互补链,进行特异性基因的扩增[2].

环介导恒温扩增技术在轮状病毒基因检测中的应用

目的建立环介导恒温扩增技术快速检测轮状病毒的方法。方法采用环介导恒温扩增反应(LAMP)技术扩增轮状病毒特异性基因,并与传统PCR技术检测结果比较。结果 LAMP法更加简便快速、且在恒温条件下进行,特异性好,且具有更高的灵敏性。结论 LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测轮状病毒提供了快速简便的新方法 。

实时荧光多酶恒温扩增技术检测小鼠细小病毒核酸的方法建立

目的旨在建立基于实时荧光多酶恒温扩增(exo-MIRA)技术的小鼠细小病毒(MVM)核酸检测新方法。方法收集2021年1月至2022年1月南京大学医学院附属金陵医院实验动物室共75份小鼠肠道内容物标本。针对MVM VP2基因的保守区域设计4对引物,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以筛选最优引物对,并设计特异性荧光探针,构建exo-MIRA检测法。通过检测梯度稀释模拟样本,进行检出限评价。检测其他小鼠病毒,包括仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠鼠痘病毒(Ect)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒(Reo),分析exo-MIRA法的交叉反应性。采用qPCR法和exo-MIRA法同时检测收集的75份标本,统计分析两种方法的一致性。以qPCR法为参比方法,评估该法的敏感度和特异度,进行诊断效能评价。结果采用exo-MIRA技术建立MVM核酸检测方法,该方法检测MVM的检出限为10 copies/μL,且与其他五种小鼠病毒无交叉反应,可特异性检出MVM。75份标本检出结果显示,exo-MIRA法和qPCR法高度一致,Kappa值为0.921(P<0.05),exo-MIRA法的敏感度为100.0%,特异度为96.7%。结论建立了一种基于实时荧光MIRA恒温扩增技术的MVM核酸检测方法,具有简单快速、实验要求低、敏感特异等优点。该方法可应用于现场复杂环境的即时检测,在实验动物质量检测应用上有一定前景。

实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术和实时荧光RT-PCR在手足口病中的应用价值

目的研究实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术和实时荧光RT-PCR在手足口病中的应用价值。方法回顾性分析106例疑似手足口病患儿的临床资料。所有患儿均进行实时荧光RT-PCR检测、实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术检测,以临床表现、实验室检查、血清和病原学的综合诊断结果为临床诊断金标准,比较不同检测方法的诊断结果及效能。结果实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术检测EV通用型、EV71、CoxA16的窗口期及平均用时均短于实时荧光RT-PCR检测,诊断效能均优于实时荧光RT-PCR检测,阳性综合诊断率高于实时荧光RT-PCR检测(P<0.05)。结论实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术在检测手足口病中具有快速、高效、诊断效能高等优势,临床推广应用价值高。

转Bt基因作物恒温扩增快速检测技术

[目的]建立一种快速检测转Bt基因作物的方法。[方法]利用Bt的Cry1ab/ac基因序列设计特异性引物,建立LAMP检测方法以及优化反应体系,并进行LAMP的特异性和灵敏度试验。[结果]成功建立转Bt基因作物的LAMP检测方法,得到最优的反应体系。在特异性试验中,转Bt基因作物基因组DNA均呈阳性,而非转基因作物、转Bar基因作物、转CPTI基因作物、转EPSPS基因作物等均为阴性;在灵敏度试验中,转Bt基因作物的最低检测限为10个拷贝。[结论]LAMP方法具有很高的特异性和灵敏度,可用于转Bt基因作物的现场快速检测。

内引物在环媒恒温基因扩增技术中的作用研究

目的研究内引物在环媒恒温基因扩增(LAMP)中的作用,确定利用LAMP的同一套特异性引物区别具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌基因的可行性。方法采用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变,使其T669→A669、T725→A725,用原LAMP特异性引物扩增含单核苷酸差异序列,观察扩增结果。结果制备的点突变模板C大小与预期值(1 371 bp)一致。LAMP扩增的伤寒沙门氏菌CMCC50098标准株DNA产物的电泳条带呈梯状,而扩增模板C未扩出反应产物。结论LAMP不能利用同一套引物扩增具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌,即可利用同一套引物区分这些病原菌。