发酵乳中植物乳杆菌依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

通过依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)技术建立一种快速检测发酵乳中植物乳杆菌的方法。根据植物乳杆菌scrB基因序列(基因号为AJ579541.1)设计特异性引物,通过实验筛选出检测体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的较优含量,达到最优反应条件。所建立的HDA方法通过人工添加植物乳杆菌确定检出限,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过扩增产物电泳和序列比对分析验证方法一致性和稳定性。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中植物乳杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的适宜添加量分别为0.15μg和5.0μg,特异性良好,与涉及的其他菌株均未发生扩增,检出限为2.8×10^(1) CFU/g,扩增序列与设计序列长度(273 bp)一致且序列同源性为100%;本研究建立的方法可以快速检测发酵乳中植物乳杆菌,具有灵敏度高、操作简单、应用前景广等特点。

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的:建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法:根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果:解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0μg。结论:解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。

酸乳中葡糖醋杆菌赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

建立酸乳中葡糖醋杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)检测方法。根据葡糖醋杆菌16S基因序列(基因号为HQ677466.1)设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的浓度。通过HDA法直接检测酸乳中的葡糖醋杆菌,并确定其检出限,在建立的HDA体系中对酸乳中多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法的特异性。结果表明:用HDA法检测酸乳中葡糖醋杆菌,得到了与设计序列长度(101 bp)一致的基因片段,检出限为102 CFU/g,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.1μg和5.0μg。该方法用于检测酸乳中葡糖醋杆菌的灵敏度高、耗时短。

单核细胞增生李斯特氏菌依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法,本研究以Lm的iap基因为目的片段设计特异性引物,建立了可在65℃恒温扩增快速(90 min)检测Lm的HDA检测方法,分别对反应体系中的MgAc2、Bst聚合酶、UvrD解旋酶、dNTPs以及引物等的浓度进行优化,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明,所建立起的检测法最低检测限为7.8×103 cfu/mL,灵敏度与普通PCR方法相当。Lm的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,具有良好的应用前景。

解旋酶恒温基因扩增方法快速检测酸乳中醋化醋杆菌

目的建立解旋酶恒温基因扩增方法(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测酸乳中醋化醋杆菌的分析方法。方法以醋化醋杆菌的16S-23S rRNA ITS序列为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,通过解旋酶恒温基因扩增方法直接检测酸乳中醋化醋杆菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果 HDA法检测酸乳中醋化醋杆菌的特异性强,实验涉及的其他菌株均未发生扩增,只有醋化醋杆菌得到与设计序列长度一致的197 bp基因片段,方法检出限为3.6×10~1 CFU/g,实验条件优化后T4 gp32、UvrD helicase的终含量分别为4.0、0.15μg。结论该方法灵敏度较高,时间较短,为酸乳中醋化醋杆菌的检测提供了新的思路,同时也为其他食品污染菌的快速检测提供了借鉴意义。

发酵乳中沙门氏菌依赖解旋酶恒温基因扩增快速检测方法的建立

建立依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中沙门氏菌方法。以沙门氏菌invA基因序列为目的基因,设计特异性引物,优化反应体系中UvrD解旋酶及T4 gp32添加量,建立最优反应体系。通过HDA方法直接检测发酵乳中沙门氏菌,扩增其产物后进行电泳检测,验证方法特异性。结果表明:采用HDA快速检测法检测发酵乳中沙门氏菌特异性良好,优化后反应体系体积50μL时,UvrD解旋酶添加量为0.10μg,T4 gp32添加量为5.0μg,得到与设计序列长度(304 bp)一致的扩增产物,检出限为2.6×10^(2) CFU/g;该方法用于快速检测发酵乳中沙门氏菌能够满足检测需求,具有较高的灵敏度、易操作,可作为一种基础且快速的方法检测发酵乳中沙门氏菌。

快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增方法的建立

建立赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的方法。选择葡萄糖杆菌ITS基因序列(基因号为KF896260.1)为目的基因,设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的添加量,建立最优反应体系。采用建立的HDA体系对多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法特异性,通过HDA法直接检测发酵乳中的葡萄糖杆菌,并确定其检出限。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中葡萄糖杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.10μg和5.0μg,扩增产物与设计序列长度(309 bp)一致,特异性良好,检出限为4.3×10^1 CFU/g。该方法用于检测发酵乳中葡萄糖杆菌的灵敏度高、耗时短。

口蹄疫病毒解旋酶恒温扩增检测方法的建立

针对FMDV编码3D蛋白(RNA聚合酶)的保守序列设计特异性引物,利用逆转录解旋酶恒温扩增技术(Reverse Transcription helicase-dependent isothermal amplification,RT-HDA)建立了口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)快速检测方法。该方法可在65℃下,120 min内实现对口蹄疫病毒保守序列的大量扩增。该方法可检测到0.2 ng的FMDV核酸量,比普通RT-PCR高10倍;具有极高的特异性,除了能对FMDV核酸进行扩增外,对其他临床症状与口蹄疫类似的病毒,如水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和水泡性口炎病毒(VSV)的核酸,则不能扩增出目的片段。FMDV的RT-HDA检测方法灵敏度和特异性高,而且不需要昂贵的仪器设备,具有广阔的应用前景。

应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23S rRNA基因部分序列设计1套(共4条)能够识别6个区域的特异性引物;优化扩增条件;评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法,成功地建立了环媒恒温基因扩增(LAMP)检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。

食品和饲料中转基因植物FMV35S启动子环介导等温扩增检测方法的建立

[目的]建立FMV35S基因启动子环介导等温扩增的检测方法。[方法]建立一种检测食品和饲料中FMV35S转基因成分的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,并利用实时浊度法对该LAMP检测方法进行灵敏度、特异性和稳定性评价。[结果]该方法的检测限为0.5%,特异性和稳定性良好。采用LAMP法与荧光PCR方法进行了实际样品对比检测,结果一致可靠。[结论]可采用LAMP法对食品和饲料中FMV35S转基因成分进行检测。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望

赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景.

猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。

应用解旋恒温基因扩增技术检测沙门氏杆菌

为寻求快速简便的检测沙门氏杆菌及其他病原生物新方法,以沙门氏杆菌invA基因为目的片段,设计特异性引物,通过条件优化,建立了检测沙门氏杆菌的HDA法,用4株沙门氏杆菌和6种其他病原菌(大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌)考核特异性,用稀释法测定灵敏度.结果表明,本研究建立的HDA法可在恒温水浴锅中进行,扩增时程75 min;阳性检测率为100%,无假阳性;用HAD法检测12份饲料样品,结果检出沙门氏杆菌呈阳性的3份,阳性率为25%.HDA法极适合基层实验室使用.

应用依赖解旋酶DNA扩增技术检测转基因大豆

目的:基于依赖解旋酶DNA恒温扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplifi cation,HDA)技术,建立快速检测转基因大豆的方法。方法:采用以CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS 3种外源基因和内源基因Lectin(大豆凝集素基因)为目的片段设计4对特异引物,建立反应体系,通过HDA方法对内源基因和3种外源基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对结果进行同源性分析。结果:建立了转基因大豆HDA检测法,检测特异性良好,3种外源基因的检出限为0.2%。结论:转基因大豆的HDA检测方法具有普通聚合酶链式反应的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,极适合基层实验室使用,具有广阔的应用前景。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展

随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等的扩增,该法具有广阔的实用前景。

环介导恒温扩增技术在轮状病毒基因检测中的应用

目的建立环介导恒温扩增技术快速检测轮状病毒的方法。方法采用环介导恒温扩增反应(LAMP)技术扩增轮状病毒特异性基因,并与传统PCR技术检测结果比较。结果 LAMP法更加简便快速、且在恒温条件下进行,特异性好,且具有更高的灵敏性。结论 LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测轮状病毒提供了快速简便的新方法 。

利用环媒恒温基因扩增法检测生猪刚地弓形虫

基于已公布的刚地弓形虫Sag2基因序列设计了1套特异引物,经过条件优化,成功建立了针对刚地弓形虫(简称弓形虫)的环媒恒温基因扩增检测法.根据扩增弓形虫和其他几种病原生物的效果对该方法进行评估.结果表明,该方法只检出致病性弓形虫,特异性良好;检测最低速殖子浓度为4个/μL.对长沙、株洲、湘潭三地生猪血样检测的结果是仔猪、成猪和种母猪弓形虫感染率分别为6.45%、7.69%和15.38%.

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。