发酵乳中植物乳杆菌依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

通过依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)技术建立一种快速检测发酵乳中植物乳杆菌的方法。根据植物乳杆菌scrB基因序列(基因号为AJ579541.1)设计特异性引物,通过实验筛选出检测体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的较优含量,达到最优反应条件。所建立的HDA方法通过人工添加植物乳杆菌确定检出限,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过扩增产物电泳和序列比对分析验证方法一致性和稳定性。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中植物乳杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32蛋白的适宜添加量分别为0.15μg和5.0μg,特异性良好,与涉及的其他菌株均未发生扩增,检出限为2.8×10^(1) CFU/g,扩增序列与设计序列长度(273 bp)一致且序列同源性为100%;本研究建立的方法可以快速检测发酵乳中植物乳杆菌,具有灵敏度高、操作简单、应用前景广等特点。

探讨恒温扩增法在下呼吸道感染病原体检测的价值

探究运用恒温扩增法(Loop—mediated isothermal amplification,LAMP)在感染人群病原体诊断方面的价值。收集2022年1-8月255名下呼吸道感染患者的痰液或肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF),运用LAMP法和痰培养法同时对其进行检测,分析病原体检出情况、恒温扩增芯片法与痰培养法符合率。运用LAMP法检出阳性标本200例,总阳性率为78.43%,共检出呼吸道病原体10种;运用痰培养法检测出阳性标本80例,总阳性率为31.37%,共检出呼吸道病原体8种。两种方法检出的铜绿假单胞菌的阳性率具有高度一致性(Kappa=0.516),鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的阳性率具有中等一致性(0.4<Kappa<0.6)。恒温扩增法的病原体检出率显著高于传统痰培养法;相较于金标准痰培养法,其对苛养菌的检测具有较好的一致性。但LAMP法检测时间更短、总阳性率更高,更有助于临床医生快速精准地识别所感染的病原体。

恒温扩增芯片法在ICU肺部感染患者下呼吸道病原体检测中的应用

目的探讨恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者下呼吸道病原体检测中的应用价值。方法收集2022年1月至2022年7月期间清远市人民医院重症监护室752例患者痰液或肺泡灌洗液标本,同时进行LAMP法和痰培养检测,比较各病原体检出率以及两种方法的一致性。结果恒温扩增芯片法检出576例阳性(76.60%),培养法检出418例阳性(55.59%),恒温扩增芯片法检出率更高,差异具有统计学意义(χ^(2)=74.064,P<0.001)。LAMP法检出率较高的病原体是鲍曼不动杆菌(45.48%),肺炎克雷伯菌(36.97%),铜绿假单胞菌(20.48%),金黄色葡萄球菌(11.84%);培养法检出率较高的病原体与LAMP一致,其检出率分别为23.80%,13.16%,7.98%,2.93%。两种方法对各病原体检出率的比较中,除结核分枝杆菌外,LAMP法对其余九种病原体的检出率均高于培养法,差异有统计学意义(P均<0.05)。两种方法的总体阳性一致性Kappa值为0.242,一致性一般。其中,对结核分枝杆菌的检出一致性较强,Kappa值为0.665;对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌检出一致性中等,Kappa值分别为0.551和0.409;对流感嗜血杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌检出一致性较差,Kappa值分别为0.079和0.150。结论恒温扩增芯片法较传统培养法,具有操作简便、速度快、阳性率高等优点,可同时检测十三种病原体,对于混合感染和苛养菌的检测效果更好,对于临床早期诊断和精准治疗有着至关重要的作用。

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的:建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法:根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果:解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0μg。结论:解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。

酸乳中葡糖醋杆菌赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

建立酸乳中葡糖醋杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)检测方法。根据葡糖醋杆菌16S基因序列(基因号为HQ677466.1)设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的浓度。通过HDA法直接检测酸乳中的葡糖醋杆菌,并确定其检出限,在建立的HDA体系中对酸乳中多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法的特异性。结果表明:用HDA法检测酸乳中葡糖醋杆菌,得到了与设计序列长度(101 bp)一致的基因片段,检出限为102 CFU/g,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.1μg和5.0μg。该方法用于检测酸乳中葡糖醋杆菌的灵敏度高、耗时短。

发酵乳中沙门氏菌依赖解旋酶恒温基因扩增快速检测方法的建立

建立依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中沙门氏菌方法。以沙门氏菌invA基因序列为目的基因,设计特异性引物,优化反应体系中UvrD解旋酶及T4 gp32添加量,建立最优反应体系。通过HDA方法直接检测发酵乳中沙门氏菌,扩增其产物后进行电泳检测,验证方法特异性。结果表明:采用HDA快速检测法检测发酵乳中沙门氏菌特异性良好,优化后反应体系体积50μL时,UvrD解旋酶添加量为0.10μg,T4 gp32添加量为5.0μg,得到与设计序列长度(304 bp)一致的扩增产物,检出限为2.6×10^(2) CFU/g;该方法用于快速检测发酵乳中沙门氏菌能够满足检测需求,具有较高的灵敏度、易操作,可作为一种基础且快速的方法检测发酵乳中沙门氏菌。

快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增方法的建立

建立赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的方法。选择葡萄糖杆菌ITS基因序列(基因号为KF896260.1)为目的基因,设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的添加量,建立最优反应体系。采用建立的HDA体系对多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法特异性,通过HDA法直接检测发酵乳中的葡萄糖杆菌,并确定其检出限。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中葡萄糖杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.10μg和5.0μg,扩增产物与设计序列长度(309 bp)一致,特异性良好,检出限为4.3×10^1 CFU/g。该方法用于检测发酵乳中葡萄糖杆菌的灵敏度高、耗时短。

解旋酶恒温基因扩增方法快速检测酸乳中醋化醋杆菌

目的建立解旋酶恒温基因扩增方法(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测酸乳中醋化醋杆菌的分析方法。方法以醋化醋杆菌的16S-23S rRNA ITS序列为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,通过解旋酶恒温基因扩增方法直接检测酸乳中醋化醋杆菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果 HDA法检测酸乳中醋化醋杆菌的特异性强,实验涉及的其他菌株均未发生扩增,只有醋化醋杆菌得到与设计序列长度一致的197 bp基因片段,方法检出限为3.6×10~1 CFU/g,实验条件优化后T4 gp32、UvrD helicase的终含量分别为4.0、0.15μg。结论该方法灵敏度较高,时间较短,为酸乳中醋化醋杆菌的检测提供了新的思路,同时也为其他食品污染菌的快速检测提供了借鉴意义。

单核细胞增生李斯特氏菌依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法,本研究以Lm的iap基因为目的片段设计特异性引物,建立了可在65℃恒温扩增快速(90 min)检测Lm的HDA检测方法,分别对反应体系中的MgAc2、Bst聚合酶、UvrD解旋酶、dNTPs以及引物等的浓度进行优化,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明,所建立起的检测法最低检测限为7.8×103 cfu/mL,灵敏度与普通PCR方法相当。Lm的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,具有良好的应用前景。

环介导恒温扩增芯片法检测下呼吸道感染病原菌的临床应用

目的探讨环介导恒温扩增芯片(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法快速检测下呼吸道感染病原菌的临床应用价值。方法收集本院2019年1月至2021年12月下呼吸道感染患者的下呼吸道标本,对同一份样本先进行常规培养再进行LAMP病原菌检测,比较两种方法对下呼吸道感染病原菌的检出率。结果一共收集1612例样本,LAMP对12种病原菌和MecA均有检出,检出阳性665例,其中单一病原菌感染474例,多重感染191例。常规培养法检出阳性310例,其中单一病原菌感染281例,多重感染29例。其中228例为两种方法检出一致,通过Kappa检验分析Pae、Aba基本一致,Kpn、Eco、Sma和Sau中等一致,Spn和Hin一般一致。经分析不同性别不同年龄间下呼吸道感染的病原菌检出率差异有统计学意义(P<0.05)。LAMP和常规培养法同时检出金黄色葡萄球菌29例,比较金黄色葡萄球菌MecA和苯唑西林最小抑菌浓度(MIC)值对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检出一致性,显示检测结果差异有统计学意义(χ^(2)=9.815,P<0.05)。结论LAMP法较常规培养法可快速检测病原菌且能提高阳性检出率。依据LAMP法的金黄色葡萄球菌和MecA检测结果可早期快速排除MRSA的定植和感染,有助于临床诊治及合理用药。

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23S rRNA基因部分序列设计1套(共4条)能够识别6个区域的特异性引物;优化扩增条件;评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法,成功地建立了环媒恒温基因扩增(LAMP)检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望

赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景.

赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展

随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等的扩增,该法具有广阔的实用前景。

利用环媒恒温基因扩增法检测生猪刚地弓形虫

基于已公布的刚地弓形虫Sag2基因序列设计了1套特异引物,经过条件优化,成功建立了针对刚地弓形虫(简称弓形虫)的环媒恒温基因扩增检测法.根据扩增弓形虫和其他几种病原生物的效果对该方法进行评估.结果表明,该方法只检出致病性弓形虫,特异性良好;检测最低速殖子浓度为4个/μL.对长沙、株洲、湘潭三地生猪血样检测的结果是仔猪、成猪和种母猪弓形虫感染率分别为6.45%、7.69%和15.38%.

恒温扩增法在下呼吸道感染病原体检测中的价值

目的探究恒温扩增(LAMP)法在下呼吸道感染(LRTI)病原体检测中的应用价值。方法收集我院255例LRTI患者的痰液或肺泡灌洗液,应用LAMP法和痰培养法检测13种常见病原体。对比两种方法对LRTI病原体检测结果的差异性和一致性,通过LAMP法研究苛养菌及不典型病原体在感染群体中是否存在性别和年龄差异。结果LAMP法检出病原体以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为主,其次为肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌;痰培养法检出病原体以肺炎克雷伯菌为主,其次为铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌。LAMP法总阳性率显著高于痰培养法(P<0.05)。两种检测方法对肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌及苛养菌的一致性程度中等。LAMP法检测结果分析苛养菌在感染群体中无性别和年龄差异,但肺炎克雷伯杆菌在感染群体中男性感染率高于女性(P<0.05);耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在老年组中感染率高(P<0.05),肺炎支原体在少年组中感染率高(P<0.05)。结论LAMP法在LRTI病原体检测中具有优越的检测性能,尤其是对苛养菌进行快速检测,且病原体阳性率高于痰培养法,具有很好的应用前景。

恒温荧光扩增法快速检测食品中金黄色葡萄球菌

目的建立恒温荧光扩增法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌.方法基于重组酶介导链替换核酸扩增技术针对金黄色葡萄球菌nuc基因的保守区域设计特异性引物和探针,建立了检测金黄色葡萄球菌的恒温荧光扩增检测方法,并评价其敏感性、特异性、重复性和符合率.结果该方法可在常温(37~42℃)实现核酸快速扩增,20 min即可完成反应;敏感性较高,金黄色葡萄球菌的检出限为9.12×10^(2) CFU/mL;特异性强,与大肠埃希氏菌O157∶H7、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌的核酸均无交叉反应;不同稀释度菌液检测阈值时间的变异系数为5.78%~5.93%,重复性较好;采用该方法与荧光聚合酶链反应方法同时对50份临床样品进行检测,总符合率均为100%,差异不显著(P>0.05).结论本研究建立的金黄色葡萄球菌恒温荧光扩增检测方法具有敏感性高、特异性强、时间短的特点,可用于金黄色葡萄球菌的快速检测.

基于CRISPR/Cas12a的叶酸代谢位点MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立

目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较。结果基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性。结论建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景。

口蹄疫病毒解旋酶恒温扩增检测方法的建立

针对FMDV编码3D蛋白(RNA聚合酶)的保守序列设计特异性引物,利用逆转录解旋酶恒温扩增技术(Reverse Transcription helicase-dependent isothermal amplification,RT-HDA)建立了口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)快速检测方法。该方法可在65℃下,120 min内实现对口蹄疫病毒保守序列的大量扩增。该方法可检测到0.2 ng的FMDV核酸量,比普通RT-PCR高10倍;具有极高的特异性,除了能对FMDV核酸进行扩增外,对其他临床症状与口蹄疫类似的病毒,如水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和水泡性口炎病毒(VSV)的核酸,则不能扩增出目的片段。FMDV的RT-HDA检测方法灵敏度和特异性高,而且不需要昂贵的仪器设备,具有广阔的应用前景。

应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。

新型恒温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌。同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;肉眼观察阳性结果出现白色混浊现象,添加1×SYBRGreenI荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为10CFU/ml,PCR方法为103CFU/ml,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法的100倍。因此,LAMP方法用于快速检测副溶血弧菌具有检测过程简单、反应结果肉眼即辨别并且灵敏度高特异性强的特点。实验装置简便,能够提供稳定热源即可,所以LAMP方法特别适合于现场快速诊断。